Материал: mass_spectr

Матрица подбирается таким образом, чтобы она активно поглощала излучение лазера. В процессе облучения над поверхностью образца создается область высокотемпературной плазмы, в которой происходит ионизация. Образующиеся ионы с помощью фокусирующего электрода выводятся из зоны ионизации и направляются в анализатор.

Успех ионизации зависит от ряда факторов.

Лазер. Использование лазерных импульсов, а не постоянного облучения неслучайно: импульсный режим работы предотвращает сильный перегрев и разложение образца. Для ионизации применяют в основном два типа лазеров – азотный и неодимовый. Оба являются ультрафиолетовыми, азотный испускает импульсы с длинной волны 337 нм, неодимовый – 355 нм, продолжительность импульсов от 0.1 до нескольких наносекунд.

Матрица. Как и в методе FAB матрица, используемая в MALDI, должна отвечать ряду критериев: а) поглощать излучение, испускаемое лазером; б) способствовать ионизации анализируемого вещества; в) хорошо растворяться в тех же растворителях, в которых растворяется аналит; г) кристаллизоваться с включением в структуру молекул анализируемого вещества; д) быть инертным по отношению к анализируемому соединению. Наиболее распространенные матрицы приведены на рисунке 13. Поскольку многие матрицы являются кислотами, в масс-спектре зачастую присутствует интенсивный сигнал иона [M + H]+.

Пробоподготовка. Важный параметр, влияющий на качество спектров. Существует много различных методов подготовки образца к анализу, наиболее простой заключается в смешивании небольшого объема раствора анализируемого соединения с раствором матрицы. После получения гомогенного раствора, в котором молярное соотношение матрица–анализируемое вещество составляет от 100:1 до 50000:1, несколько микролитров его наносятся на подложку и высушивается. При этом происходит кристаллизация матрицы с включением анализируемого вещества в кристаллическую решетку.

21

Рисунок 13 – Некоторые органические соединения, используемые в качестве матриц в методе MALDI. Жирным шрифтом указаны их общепринятые сокращения

На рисунке 14 приведен типичный MALDI масс-спектр.

NH N

N HN

Mr = 782,43

Рисунок 14 – MALDI спектр тетрамезитилпорфирина, матрица – CCA 22

Как отмечалось выше, огромная ценность метода MALDI заключается в возможности анализа сложных молекул, например, белков, полимеров, нуклеиновых кислот. Однако вид спектров тяжелых молекул (масса более 2000 Да) сильно отличается от классических спектров электронной или химической ионизации из-за наличия большого числа изотопных пиков. Анализ таких спектров требует специальных навыков.

Преимущества:

Быстрое получение масс-спектра;

«Мягкая» ионизация, фрагментация или отсутствует, или незначительна;

Большой диапазон анализируемых масс, что позволяет анализировать сложные биомолекулы.

Недостатки:

Отсутствие фрагментации не позволяет судить о структуре;

Требуется специальный анализатор, совместимый с импульсным режимом работы;

Вид спектра чувствителен к типу используемой матрицы;

В области низких масс доминируют ионы матрицы.

Диапазон масс: до 500 тыс. Да.

1.6 Ионизация распылением в электрическом поле

(electrospray ionization, ESI)

За разработку основ этого метода Джонн Фенн вместе с основоположником техники MALDI получил в 2002 г. Нобелевскую премию по химии. Оба ученых получили премию за тот вклад, которые внесли методы MALDI и ESI в изучение биологически значимых молекул.

23

Схема установки для ионизации распылением в электрическом поле приведена на рисунке 15.

Рисунок 15 – Ионизация распылением в электрическом поле

Раствор вещества в определенном растворителе поступает в тонкий капилляр (диаметр около 0.1 мм), на который подается высокое напряжение (2–5 кВ). Раствор выходит из капилляра в виде очень мелкого аэрозоля, состоящего из заряженных капель. Такой процесс называется распылением. Заряженные капли движутся в направлении анализатора к противоэлектроду, по пути движения капли уменьшаются в размерах за счет испарения, которому способствует ток сухого азота в первом сепараторе и вакуум во втором. Достигая определенного критического размера, при котором силы поверхностного натяжения не способны противостоять силам кулоновского отталкивания, капли взрываются (кулоновский взрыв), распадаясь на более мелкие капли. Этот процесс продолжается снова и снова до тех пор, пока не заканчивается образованием иона анализируемого соединения. Это объяснение является одним из многих, и споры о механизме ионизации в условиях электрораспыления продолжаются до сих пор.

Поскольку ионизация формально протекает из раствора, присутствующие в нем частицы могут давать с молекулами анализируемого вещества различные аддукты. По этой причине в масс-спектре вместо молекулярного иона присутствуют

ионы [M + H]+, а если в растворитель добавлены соли щелочных металлов

24

или аммония (для повышения ионизирующей способности) то, например, ионы

[M + Na]+ или [M + NH4]+ (рисунок 16).

Рисунок 16 – Масс-спектр производного бензимидазола, снятый в условиях ионизации распылением в электрическом поле, растворитель – ацетонитрил

Если анализируемое вещество содержит несколько основных центров, в массспектре появляется серия ионов типа [M + nH]n+. Данный факт крайне важен в анализе сложных молекул, например, белков. Дело в том, что анализатор массспектрометра разделяет ионы не по массам, а по отношению массы к заряду. В результате ион с массой 100 тыс. Да и зарядом в 100 будет регистрироваться при значении m/z = 1000 (рисунок 17). Это позволяет расширить предел анализируемых масс до 200 тыс. Да, а зарегистрированный на сегодняшний день рекорд составляет 110 млн. Да.

Успех получения хорошего ESI-спектра зависит от ряда факторов. Растворитель. По ряду причин при ионизации распылением в электрическом поле используются только полярные растворители, наиболее распространенные из которых вода, ацетонитрил, метанол, а25также их смеси. Возможно применение