Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

1.3. Промивний розчин 100 мл; 1.4. Розчин носія (т-РНК) 300 мкл; 1.5. Вода деіонізована 5 мл; 1.6. Хлороформ 12 мл.

2.Комплект для проведення ПЛР (ампліфікації). Дані комплекти випускаються в різних форматах в залежності від кількості реакцій і ступеня їх готовності до постановки реакції.

3.Комплект для детекції продуктів ампліфікації. Готові комплекти і окремі реагенти.

Готові комплекти:

Комплект № 1 (кат. № 030106) (на 100 -150 зразків) агароза-2х2г, 50хТАЕ буфер-25 мл, розчин бромистого етидію-30мкл.

Комплект № 2 (кат. № 030107) (на 120 зразків) 2% агарозному гель (40 лунок)-3шт, 50хТАЕ буфер-25 мл.

Окремі реагенти: агароза (100г/уп.; 2г/уп.) (кат. № 030101); розчин бромистого етидію (1мл/уп.) (кат. № 030104); 50хТАЕ буфер (200 мл/уп.; 120мл/уп.) (кат. № 030102); 2% агарозний гель для електрофорезу (40 лунок) (1шт/уп.; 5шт/уп.) (кат. № 030108).

Проведення дослідження

1.Вибір аналізованого матеріалу. Вибір клінічного матеріалу для дослідження визначається найбільш імовірним місцем локалізації збудника.

2.Взяття, доставка та зберігання матеріалу. Для отримання сироватки венозну кров збирають в суху одноразову пластикову пробірку і дають крові згорнутися (30 хв. при кімнатній температурі до повного утворення згустку). Пробірку центрифугують 10 хв. при 3000 об/хв. при кімнатній температурі, отриману сироватку переносять в чисту суху поліпропіленову пробірку типу Еппендорф об'ємом 1,5 мл, використовуючи наконечник

зфільтром.

Для отримання плазми венозну кров збирають в одноразову пластикову пробірку з розчином антикоагулянта (0,05 М розчин ЕДТА або 4% розчин цитрату натрію в співвідношенні 500 мкл крові на 50 мкл антикоагулянта). Гепарин використовувати не рекомендується. Пробірку центрифугують 20 хвилин при 3000 об/хв. при кімнатній температурі, отриману плазму (верхня фаза) переносять індивідуальним наконечником з фільтром в суху одноразову пластикову пробірку і використовують для виділення ДНК.

Для отримання клітинної маси крові 500 мкл венозної крові зібрати в одноразову пластикову пробірку з 50 мкл розчину антикоагулянта (0,05 М розчин ЕДТА або 4% розчин цитрату натрію). Гепарин використовувати не рекомендується. Пробірку центрифугувати 5 хв. при 3000 об/хв., при

кімнатній температурі. Плазму (верхня фаза) відкинути з використанням індивідуального наконечника. Отриману клітинну масу крові використовують для виділення ДНК.

Цілісна нативна кров зберіганню не підлягає!

Неохолоджені зразки сироватки, плазми і клітинної маси можуть бути використані протягом 2-х годин для виділення ДНК. Допускається зберігання при +4 ... +8оС не більше 1 доби, при -18 ...-20оС-не більше 2-х тижнів.

Доставка оброблених проб в лабораторію повинна проводитися в термосі з льодом або в термоконтейнері протягом 12 год.

3. Виділення ДНК з біопроб:

3.1.У чисті поліпропіленові пробірки типу Еппендорф об'ємом 1,5 мл внести по 3 мкл носія і 450 мкл денатуруючого розчину.

Денатуруючий розчин містить фенол. Уникати попадання його на шкіру та слизові оболонки.

Пронумерувати пробірки і розташувати відповідним чином в штативі.

3.2.Додати 50 мкл досліджуваної сироватки або плазми (або 100 мкл клітинної маси крові) у відповідні пробірки, використовуючи наконечники з фільтрами. Пробірки щільно закрити.

3.3.Ретельно перемішати на вортексі протягом 10 сек., а потім інкубувати при кімнатній температурі 10 хвилин.

3.4.Центрифугувати протягом 15 секунд при 12 тис. об/хв. Високошвидкісне центрифугування проводити в центрифузі з кришкою, для забезпечення щільного притискання кришок пробірок. Після кожного етапу центрифугування бажано протерти внутрішню поверхню притискної кришки і поверхню ротора дез. розчином.

3.5.Додати 100 мкл хлороформу, щільно закрити пробірки і перемішати на вортексі 5 секунд.

3.6.Центрифугувати 5 хвилин при 12 тис. об/хв.

3.7.Перенести до 300 мкл верхньої водної фази в чисту поліпропіленову пробірку типу Еппендорф об'ємом 1,5 мл, що містить 300 мкл ізопропілового спирту, використовуючи наконечники з фільтрами. Перемішати на вортексі 5 сек.

3.8.Центрифугувати 12 хвилин при 12 тис. об/хв.

В результаті даної маніпуляції утворюється напівпрозорий пухкий осад. 3.9. Видалити супернатант вакуумним аспіратором в колбу-пастку, з використанням одноразових наконечників, залишаючи на дні пробірки близько 20 мкл рідини. Дану маніпуляцію проводити з особливою

обережністю, поступово видаляючи супернатант тільки з верхнього шару рідини і не допускаючи захоплення пухкого осаду. Рекомендується орієнтувати пробірки в роторі центрифуги, позначаючи таким чином місце розташування осаду.

3.10.У пробірку з осадом додати 1 мл розчину для промивання. Пробірки щільно закрити, перемішати на вортексі і центрифугувати 10 хвилин при 12 тис. об/хв.

3.11.Видалити супернатант якомога повніше вакуумним аспіратором

вколбу-пастку, не захопивши при цьому осад. Осад підсушити 20-30 хвилин при кімнатній температурі, залишаючи пробірки відкритими.

3.12.Додати 50 мкл деіонізованої води, пробірки закрити, інкубувати 10 хвилин при кімнатній температурі, потім перемішати струшуванням.

Розчин очищеної ДНК можна зберігати при -18 ...-20оС протягом двох тижнів.

4. Проведення ПЛР (ампліфікація)

4.1.Приготувати і пронумерувати пробірки для проведення ампліфікації місткістю 0,5 мл (або 0,2 мл) відповідно до кількості аналізованих проб на наявність ДНК обраного збудника. Підготувати та промаркувати пробірки для позитивного (маркування «К +») і негативного (маркування «К-») контрольних зразків. При використанні комплекту ГЕРПОЛ 1 +2 реакція з двома позитивними контрольними зразками.

Слід зауважити, що для комплектів реагентів формату OneStep (суміш, готова до застосування, розфасована по індивідуальним ампліфікаційним пробірках) маркуються пробірки з готовою сумішшю для аналізованих проб і пробірки для негативного контрольного зразка. Пробірки з позитивним контрольним зразком повністю готові до постановки в ампліфікатор. Проведення ампліфікації для наборів формату One Step починається з п.4.7.

4.2.За 20-30 хвилин до приготування робочої ампліфікаційної суміші витягти комплект реагентів для ПЛР (ампліфікації) з морозильника, розморозити вміст (бажано помістити пробірку з Taq-полімеразою в крижану баню). Пробірки з реакційною сумішшю і повністю розмороженим розчином розріджувача ретельно струснути для перемішування вмісту.

4.3.З компонентів набору приготувати суміш реагентів для ампліфікації з розрахунку на 1 пробу: рекомендується готувати суміш реагентів не менше ніж на 5 реакцій для достовірного дозування обсягу ферменту - 17,5 мкл розріджувача, 2,5 мкл реакційної суміші, 0,2 мкл Taqполімерази.

При приготуванні робочої ампліфікаційної суміші необхідно всі компоненти додавати окремими наконечниками.

4.4.Після додавання Taq-полімерази, яке проводиться в останню чергу, необхідно ретельно перемішати суміш піпетування.

4.5.Додати по 20 мкл робочої ампліфікаційної суміші в усі пробірки, підготовлені для ампліфікації.

4.6.Додати в усі пробірки по 1 краплі (близько 25 мкл) мінерального масла.

4.7.Внести 5 мкл зразка з обробленої аналізованої проби (см п. виділення ДНК) у відповідну пробірку з робочою ампліфікаційною сумішшю під шар масла.

4.8.Внести в пробірки для позитивних контрольних зразків по 5 мкл відповідного позитивного контрольного зразка ДНК, а в пробірку для негативного контрольного зразка - 5 мкл розріджувача, використовуючи індивідуальні наконечники з фільтрами.

Слід прийняти до ваги, що у комплектах реагентів формату One Step (суміш, готова до застосування, розфасована по індивідуальним ампліфікаційних пробірках) позитивний контрольний зразок повністю готовий до постановки в програмований термостат (ампліфікатор).

4.9.Пробірки закрити і центрифугувати протягом 3-5 секунд при 1,5- 3000 об/хв. при кімнатній температурі (+18 ... +25оС) на мікроцентри- фузі-вортексі.

4.10.Перенести пробірки в прогрітий до температури +93оС (або +94оС) програмований термостат (ампліфікатор) і провести ампліфікацію за відповідними виду набору програмами:

До уваги: у комплектах реагентів формату OneStep (готова до застосування суміш розфасована по індивідуальним ампліфікаційним пробіркам) позитивний контрольний зразок повністю готовий до постановки в програмований термостат (ампліфікатор).

4.11.Пробірки закрити і центрифугувати протягом 3-5 секунд при 1,5- 3000 об/хв. при кімнатній температурі (+18 ... +25оС) на мікроцентри- фузі-вортекс.

4.12.Перенести пробірки в прогрітий до температури +93оС (або +94оС) програмований термостат (ампліфікатор).

5.Провести ампліфікацію за наступними програмами: ПОЛІГЕП В (HBV), ГЕРПОЛ (HSVII) ГЕРПОЛ1+2 (HSVI+II), ЕБАРПОЛ (EpsteinBarr virus), ЦИТОПОЛ (Cytomegalovirus) та інш.

6.Детекція продуктів ампліфікації. Поділ продуктів ампліфікації методом горизонтального електрофорезу.

6.1.Залити в апарат для електрофорезу ТАЕ буфер, приготований на дистильованій воді розведенням 50хТАЕ в 50 разів.

6.2.До 2,0 г агарози додати 2 мл 50хТАЕ буфера і 100 мл дистильованої води.

6.3.Приготовлену суміш розплавити на електричній плиті або в мікрохвильовій печі. Додати до 100 мл розплавленої агарози 10 мкл 1% розчину бромистого етидію. Перемішати.

6.4.Охолодити розплавлену агарозу до температури 50-60оС і залити

впланшет для заливки гелю. Для отримання в агарозному гелі кишень для нанесення зразків встановити на планшет гребінку, використовуючи затискач типу «бульдог». Після застигання агарози обережно вийняти гребінець з гелю і перенести планшет з гелем в камеру для проведення електрофорезу.

6.5.Нанесті в кишені гелю по 10-15 мкл ампліфікату в послідовності відповідної нумерації проб. Нанести позитивні і негативні контролі.

6.6.Підключити електрофоретичної камеру до джерела живлення і задати напругу, відповідну напруженості електричного поля 10-15 В/см гелю. Провести електрофоретичний поділ продуктів ампліфікації в напрямку від катоду (-) до аноду (+). Контроль за електрофоретичної поділом здійснюється візуально по руху смуги барвника. Смуга барвника повинна пройти від старту 1,5-2 см.

Візуалізація результатів електрофорезу

6.7.Вийняти гель з форми і перенести його на скло УФ-трансілюмі-

натора.

УВАГА! З гелем агарози слід працювати в рукавичках. Бромистий етидій є сильним мутагеном.

6.8.Включити трансілюмінатор і проаналізувати результати аналізу. Фрагменти аналізованої ДНК проявляються у вигляді світних оранжевочервоних смуг при опроміненні УФ-випромінюванням з довжиною хвилі 310 нм.

7.Аналіз результатів

7.1. У негативному контрольному зразку (К-) для наборів з внутрішнім контролем повинна виявлятися одна смуга оранжево-червоного кольору, що відповідає внутрішньому контролю (ВК) (табл. 19). Поява другої смуги на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору.

Для наборів без внутрішнього контролю смуги повинні бути відсутні. Поява смуги на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору.