Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

призводить до того, що зародок не розпізнається організмом матері як плід, а сприймається як змінена клітина власного організму, проти якої починає працювати система знищення. Як наслідок імунітет матері пригнічує імплантацію ембріона. У кожному третьому випадку безпліддя або звичне невиношування вагітності обумовлюються генетичними особливостями пари.

Важливе значення для діагностики імунних форм невиношування вагітності має визначення генотипу подружжя за HLA-антигенами II класу. Бажано проведення фенотипування по HLA-DR і HLA-DQ антигенам, особливо по HLA-DR, так як ці антигени представлені на клітині в незрівнянно більшій кількості і є найбільш імуногенно активними. Імунологічна несумісність партнерів може бути констатована, коли є три збіги між алельними варіантами генів DRB1, DQA1, DQB1 у обстежуваного подружжя.

Проблема раннього невиношування вагітності при відсутності аномалій каріотипу найчастіше має імунологічну природу. В даний час все більше дослідників приходять до висновку про тісний взаємозв'язок і взаєморегуляцію між ендокринною та імунною системами, що реалізується в ендометрії на ранніх етапах імплантації. Сенсибілізація вагітних до батьківських HLA-антигенів плоду, схожість подружжя за HLA, присутність в HLA-фенотипі батьків певних антигенів призводить до спонтанних викиднів, важкому гестозу вагітності, вроджених вад розвитку плоду, зниження опірності потомства до несприятливих факторів навколишнього середовища.

Для подолання проблеми схожості подружжя за HLA-антигенами існує кілька видів терапії: імунізації матері концентрованою культурою лімфоцитів чоловіка, таким чином, що антигенне навантаження збільшується в 10000 разів порівняно з нормою; імунотерапія препаратами імуноглобулінів людини, фармакологічна дія при цьому: імуномодулююча, імуностимулююча.

Значення HLA-типування та генотипування в трансплантології.

В даний час селекція донора і реципієнта по HLA-антигенам з використанням ДНК-типування стала рутинним методом у імунологічних лабораторіях трансплантаційних центрів. Дані останніх років свідчать, що виживаність трупного ниркового алотрансплантату протягом 1 року при підборі пари донор-реципієнт за допомогою ДНК-типування склала 90%. У той же час при підборі пари за допомогою серологічного типування ця ж цифра дорівнювала 68%.

Взаємозв'язок антигенів системи HLA зі схильністю до захворювань. Вивчення зв'язків HLA-системи з деякими захворюваннями має важливе значення для епідеміології, нозології, діагностики, прогнозу та лікування (табл. 18).

Значення HLA-типування та генотипування при цукровому діабеті.

Цукровий діабет I типу є захворюванням із спадковою схильністю, яка визначається несприятливою комбінацією нормальних генів, більшість з яких контролюють різні ланки аутоімунних процесів.

Гени схильності до цукрового діабету 1 типу розташовуються на різних хромосомах. В даний час відомо більше 15 таких генетичних систем. З них найбільш вивченими є гени 2 класу HLA-області, розташованої на короткому плечі 6 хромосоми.

Ризик розвитку цукрового діабету у братів і сестер може бути також оцінено за ступенем їх HLA-ідентичності з хворим на діабет: у тому випадку, якщо вони повністю ідентичні, ризик найбільш високий і становить близько 18%, у наполовину ідентичних братів і сестер ризик становить 3%, а у повністю різних - менше 1%.

Дослідження генетичних маркерів дозволяє виділити групи різного ризику розвитку цукрового діабету, що визначає різну тактику за ранньою доклінічною діагностикою захворювання. Крім того, дослідження генетичних маркерів суттєво підвищує прогностичну цінність імунологічних та гормональних досліджень. У таблиці 19 представлені алелі генів HLA II класу, пов'язаних з ризиком розвитку діабету 1 типу.

Таблиця 19

Алелі генів HLA II класу, пов'язані з ризиком розвитку діабету 1 типу

Не менш важливим є визначення HLA-фенотипу за допомогою ДНКтипування при вирішенні питання про спірне батьківство. У цьому досить відповідальному і делікатному питанні використання ПЛР також підвищує точність аналізу.

Нарешті, важливим є практичне застосування ПЛР для ідентифікації ДНК мікроорганізмів при проведенні діагностики інфекційної патології. Досвід, накопичений за останній час, показує величезні перспективи використання ПЛР в цій галузі.

Виявлення специфічних ділянок ДНК збудників інфекцій методом полімеразної ланцюгової реакції з електрофоретичною детекцією.

Принцип методу. В основі методу лежить виявлення специфічного фрагмента ДНК мікроорганізму шляхом накопичення (ампліфікації) копій даного фрагмента (ДНК-мішені) в процесі синтезу нових ланцюгів ДНК.

Полімеразна ланцюгова реакція складається з багаторазово повторюваних циклів синтезу ДНК-мішені у присутності термостабільної ДНКполімерази, дезоксинуклеозидів-трифосфатів (ДНТФ), відповідного сольового буфера і олігонуклеотидних затравок - праймерів, що визначають межі ампліфікованої ділянки ДНК-мішені.

Кожен цикл складається з трьох стадій з різними температурними режимами. На першій стадії при 94оC відбувається поділ ланцюгів ДНК, потім при 57-62оС - приєднання (отжиг) праймерів до гомологічних послідовностей на ДНК-мішені, і при температурі 72оC протікає синтез нових ланцюгів ДНК шляхом подовження праймера в напрямку 5'-3'.

У кожному циклі відбувається подвоєння числа копій ампліфікованої ділянки, що дозволяє за 35 циклів напрацювати фрагмент ДНК, обмежений парою обраних праймерів, в кількості, достатній для його детекції за допомогою електрофорезу у гелі.

Проведення ПЛР-аналізу включає 3 лабораторних етапи:

1)обробка клінічних проб (виділення ДНК);

2)постановка реакції ПЛР (ампліфікація);

3)детекція продуктів ампліфікації (у даній методиці - електрофоретичний поділ продуктів в агарозному гелі).

Необхідне обладнання та витратні матеріали

1 етап - виділення ДНК з біопроб: ламінарний бокс 2 класу захисту; твердотільний термостат для пробірок 1,5 мл типу Еппендорф, що підтримує температуру до 99оС; високошвидкісна центрифуга для пробірок 1,5 мл 8-12 тис. об/хв.; мікроцетріфуга-вортекс 1,5-3тис. об/хв.; піпетки-дозатори змінного об'єму (5-50; 20-200; 100-1000 мкл); вакуумний

аспіратор (насос) з колбою-пасткою; штатив для зберігання пробірок 1,5 мл; штатив для пробірок 1,5 мл «робоче місце»; одноразові наконечники для дозаторів до 200 мкл і до 1000 мкл; холодильник з морозильною камерою для зберігання клінічного матеріалу; одноразові рукавички; комплект «Набір для виділення ДНК/РНК із сироватки і плазми крові» (універсальний для всіх збудників, присутніх в аналізованому матеріалі).

2 етап - проведення ПЛР (ампліфікація): ПЛР-бокс з УФ-лампою; програмований термостат ампліфікатор); мікроцентрифуга-вортекс 1,5- 3 тис. об/хв. (далі вортекс); піпетка-дозатор змінного об'єму 5 - 50 мкл для роботи з біопроба; піпетки-дозатори змінного об'єму (0,5 - 10; 5-50; 20-200; 100-1000 мкл) для приготування робочої суміші реагентів; одноразові поліпропіленові мікропробіркі 0,5 мл (або 0,2 мл) для ампліфікації; одноразові наконечники до 200 мкл і до 1000 мкл для приготування робочої суміші реагентів; одноразові наконечники з фільтром (аерозольним бар'єром) до 100 або до 200 мкл для біопроб; штатив для пробірок 0,5 мл (або 0,2 мл) «робоче місце»; штативи для наконечників 200 мкл; одноразові рукавички; ємність для скидання використаних наконечників; холодильник з морозильною камерою для зберігання вихідних реагентів; комплект реагентів для проведення ПЛР (індивідуальний для кожного збудника).

3 етап - детекція продуктів ампліфікації: камера для горизонтального електрофорезу, джерело постійного струму з напругою не менше 150 В; УФ-трансілюминатор; СВЧ-піч для плавлення агарози; технічні ваги для зважування агарози; аквадистилятор; відеосистема для документування гель-електрофореграм з світлозахисним кабінетом або тубусом, підключена до персонального комп'ютера; піпетка-дозатор змінного об'єму 5 - 50 мкл для нанесення зразків на гель; піпетка-дозатор змінного об'єму 100-1000 мкл; одноразові наконечники до 200 мкл для нанесення зразків; одноразові наконечники до 1000 мкл; штатив для пробірок 0,5 мл (або 0,2 мл) «робоче місце»; агароза, розчин бромистого етидію, 50хТАЕ буфер для приготування гелю і проведення електрофорезу (або готовий комплект реагентів для електрофоретичної детекції); пластикова ємність великого об'єму для дезактивації буфера і гелів.

Склад наборів реагентів для ПЛР

До складу набору реагентів входять три комплекти:

1. Комплект для пробопідготовки (виділення ДНК). «Набір для виділення ДНК/РНК із сироватки або плазми крові» (кат. № 020201) (на 100 зразків): 1.1. Денатуруючий розчин 45 мл; 1.2. Ізопропіловий спирт 30 мл;