Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

(HLA - антигени). HLA - human leucocyte antigens - антигени тканинної сумісності (cінонім: MHC - major histocompatibility complex - головний комплекс гістосумісності). Кожна людина володіє індивідуальним набором HLA - антигенів.

Молекули HLA виконують роль своєрідних "антен" на поверхні клітин, що дозволяють організму розпізнавати власні і чужі клітини (бактерії, віруси, ракові клітини і т.д.) і при необхідності запускати імунну відповідь, що забезпечує вироблення специфічних антитіл і видалення чужорідного агента з організму.

Склад кожного антигену HLA кодується відповідним HLA-геном 6-ї хромосоми. Інакше кажучи, індивідуальне поєднання HLA-антигенів у конкретної людини визначається індивідуальним поєднанням HLA-генів. Поєднання HLA генів, що отримуються від батьків, настільки ж індивідуально, як і відбитки пальців. HLA-гени успадковуються по кодомінантному типу, тобто одну хромосому дитина успадковує від матері, а іншу - від батька. Таким чином, у людини два гаплотипи і кожна клітина організму несе на собі диплоїдний набір антигенів, один з яких успадковується від матері, а інший - від батька. Виняток становлять статеві клітини (яйцеклітина і сперматозоїд), кожна з яких містить в своєму ядрі тільки по одному гаплотипу.

Антигени гістосумісності, що виявляються на клітинах конкретної людини, складають HLA-фенотип цієї людини. Для його визначення необхідно провести фенотипування клітин індивіда. Як правило, "типуються" лімфоцити периферичної крові. Щоб встановити гаплотипи обстежуваного і, відповідно, його генотип - послідовність розташування генів у хромосомі, необхідно провести типування батьків.

Гени, що кодують HLA розташовані в 7-ми областях (локусах) 6-ої хромосоми: HLA-A, B, C, D (фактично, складається з 4 локусів: власне HLA-D і HLA-DP), DQ, DR.

Кожен з генів може мати багато десятків варіантів (алелей) - їх різноманітні поєднання і формують безліч комбінацій генів. Саме алелі, виявлені при дослідженні, вказуються в бланку результатів HLA-типування.

Виділяють 2 класи антигенів HLA. До класу I відносяться антигени локусів A, B і C, а до класу II - антигени локусів DR, DP і DQ. Антигени класу I присутні на поверхні всіх клітин (а також - тромбоцитів), антигени класу II - на поверхні клітин, що беруть участь в імунологічних реакціях (B-лімфоцитів, активованих T-лімфоцитів, моноцитів, макрофагів і дендритних клітин).

Гени HLA позначаються тими ж літерами, що і закодовані ними антигени HLA. Назви генів і антигенів HLA складаються з однієї або декількох літер і цифр, наприклад A3, B45, DR15, DQ4. Буква позначає ген (область і локус), а цифри - алель цього гену, при цьому цифрові позначення присвоюються в міру відкриття нових алелей.

Поза вагітністю імунні клітини, що циркулюють в організмі, вистежують на поверхні клітин білковий код - білки тканинної сумісності. І якщо виявляються клітини зі зміненою структурою (це занесені мікроби або змінені клітини самого організму), організм негайно видає імунну відповідь - атипові клітини знищуються.

При спадкуванні антигенів тканинної сумісності дитина отримує по одному гену кожного локусу від обох батьків, тобто половина антигенів тканинної сумісності успадковується від матері і половина від батька. Таким чином, дитина є наполовину чужорідним для організму матері. Невідповідність подружжя за HLA-антигенів і відміну клітин плоду від материнського організму є нормальним фізіологічним явищем, необхідним для збереження і виношування вагітності. Ця "чужорідність" запускає імунологічні реакції, спрямовані на збереження вагітності.

При настанні вагітності з лімфоцитів ендометрію формується клон імунних клітин, що виробляє спеціальні "захисні" (блокуючі) антитіла, проти батьківських HLA-антигенів. Ці антитіла блокують HLA-антигени батька від ефекторних клітин імунної системи матері, вони захищають плід від материнських природних кілерів, що сприяють відторгненню ембріона. "Блокуючі" антитіла до батьківських HLA-антигенів (вони називаються APLA - anti pater leukocytes antibody), експресуються лімфоцитами ендометрію. APLA виявляють уже на 5-му тижні вагітності. APLA-антитіла виробляються при антигенних відмінностях подружжя за HLA-системі II класу. Тому під час вагітності плід і його клітинні структури невиразні для імунної системи материнського організму.

Лімфоцитотоксичний тест

До теперішнього часу в більшості лабораторій HLA-A. В, С і DRантигени визначають за допомогою серологічних методів, зокрема, лімфоцитотоксичного тесту. Цей тест заснований на здатності анти-НLА- антитіл у присутності комплементу руйнувати лімфоцити, що несуть відповідні антигенні детермінанти. Загибель клітин демонструється за допомогою додавання трипанового синього. При цьому мертві, пошкоджені клітини фарбуються, і під мікроскопом вираховується їх кількість.

Мікролімфоцитотоксичний тест є модифікацією лімфоцитотоксичного тесту. Для його постановки використовують всього лише 1 мкл типуючих сироваток, а також невелика кількість клітин. Мікролімфоцитотоксичний тест є стандартним і використовується у всіх типуючих лабораторіях світу. Набір типуючих сироваток (типуюча панель) створюється в результаті досліджень із зразків сироваток, що містять анти- НLА-антитіла. Ці антитіла можуть індукуватися під час вагітності, при гемотрансфузіях, а також в результаті пересадки алотрансплантатів. Основними продуцентами типуючих сироваток є жінки, що багато народжували, які імунізуються HLA-продуктами чоловіка під час виношування плоду.

Для виявлення класичних антигенів системи HLA локусів А, В, С

іDR використовується спеціальні антисироватки, що містять антитіла до вказаних антигенів. Найбільш поширеними є 2 види серологічних реакцій мікролімфоцитотоксичності для серологічного HLA-типування: 1) HLA-типування на планшетах Terasaki методом мікролімфоцитотоксичності (CDC) та 2) визначення HLA антигенів методом ELISA з використанням Lambda Monoclonal Trays.

1). Комплемент-залежний мікролімфоцитотоксичний тест Lambda Cell Tray™ (LCT™) призначений для скринінгу сироватки на наявність HLA антитіл I і II класу в комплемент-залежному лімфоцитотоксичному тесті. Набори Lambda Cell Tray™ 30Т, 60т і 72Т призначені для скринінгу

івизначення специфічності HLA антитіл I класу. Набір Lambda Cell Tray™ 60В призначений для визначення специфічності HLA II класу.

Принцип методу. Лімфоцити, що несуть відомі антигени на поверхні, інкубують із зразком сироватки та кролячим комплементом. У разі, якщо сироватка містить специфічні антитіла до цих антигенів, запускається процес лізису клітини. Якщо дослідна сироватка містить HLA антитіла, то вони можуть бути визначені.

LCT™ Lambda Cell Tray™ являє собою заморожену клітинну панель, розроблену для визначення рівня PRA і скринінгу HLA антитіл. LCT™ пропонує різноманітну клітинну панель для цитотоксичного скринінгу антитіл в людській сироватці. Планшети складаються із заморожених

впланшеті Терасакі відібраних лімфоцитів.

2)ELISA тест з використанням планшет Lambda Antigen Tray ™ (LAT) Призначений для визначення HLA-специфічних антитіл в сироватці

у реципієнтів до і після трансплантації. Характеризується високою специфічністю - в наборах LAT™ використані очищені антигени HLAI і II класу. Набір LAT™ розпізнає як цитотоксичні антитіла, так і антитіла не зв'язані з комплементом, дозволяє розрізнити специфічність HLAI і II класу, визначає IgG і IgM антитіла, включає антигени рідкісних алелів HLA.

Принцип методу LAT ™ - це пре-калібровані реагенти ELISA для визначення IgG антитіл до молекул HLAI і II класів в людській сироватці. Певні кількості HLA антигенів, очищених методом афінної хромотографії, нанесені в різні лунки планшета Терасакі. Специфічне зв'язування антитіл з тестованого зразка з будь-яким з цих антигенів виявляють за допомогою антитіл, кон'югованих з лужною фосфатазою, які дізнаються тільки людські IgG. Кількісні визначення ступеня реакції визначають спектрофотометрично, після додавання відповідного хромогенного субстрату. Якісні визначення специфічності антитіл визначають шляхом аналізу LAT ™ карти реактивності з використанням відповідних LAT ™ робочих таблиць.

LAT™ планшети з антигенами Lambda (Lambda Antigen Trays™, LAT™) є очищені комплекси HLA класу I і II, нанесені на планшети Терасакі, і призначені для визначення HLA IgG антитіл. При додаванні сироватки пацієнта, антитіла зв'язуються з очищеними HLA антигенами. Панель HLA антигенів дозволяє реєструвати зв'язаний і не зв'язаний комплемент IgG антитіла.

LAT™ Mixed метод з використанням планшетів зі змішанням анти- генами-метод попереднього скринінгу HLA антитіл, який дозволяє тестувати кілька зразків на одному планшеті. Планшети LAT ™ Mixed містять певний набір HLA антигенів, включаючи рідкісні, і розпізнає як цитотоксичні антитіла, так і антитіла, що не зв'язуються з комплементом.

LAT™ Single Antigen метод з використанням одного антигену - це метод для реєстрації та визначення типу HLA антитіл в пацієнтах з високим рівнем PRA. Всі лунки планшет Терасакі для LAT ™ Single Antigen покриті однаковими антигенами. LAT ™ SingleAntigen визначає антитіла зі слабкою специфічністю, які можуть бути не виявленими іншими методами на тлі антитіл проти антигенів, що представлені в більшій кількості. За допомогою панелі очищених антигенів HLA точно ідентифікується специфічність антигенів у сироватці з високим рівнем PRA.

Молекулярне HLA-генотипування

Раніше, коли основним об'єктом дослідження служили тільки антигени системи HLA, уявлення про комплекс генів HLA могли формуватися

восновному на аналізі непрямих даних, що включають вивчення антигенів системи HLA в популяціях, сімейному аналізі, реакціях, субстратом яких були HLА-антигени. Тепер, завдяки розвитку молекулярної генетики та імунохімії, з'явилася можливість не тільки проводити тонкий аналіз HLA-антигенів, а й вивчити самі гени HLA. Особливий прогрес у цьому напрямку було досягнуто після відкриття і впровадження в дослідження в галузі вивчення необхідні для досліджень ділянки ДНК, які,

всвою чергу, відкрили широкі можливості для швидкого і точного аналізу молекулярного поліморфізму HLA.

Молекулярне HLA генотипування за допомогою методу ПЛР виявляє різні алелі HLA на рівні ДНК. Це дає можливість визначати ті алелі генів HLA класу II, які важко виявити за допомогою серологічного типування, або зовсім не можливо. Так, наприклад, за допомогою серологічної техніки в локусі DR виявлено 14 антигенів, а за допомогою ДНК-типу- вання - понад 100 алелів. HLA-фенотип записують, дотримуючись числового порядку HLA-антигенів, згідно з номенклатурою. Наприклад: HLA-фенотип суб'єкта-Al, 2; B5, 12; DR2, 5; DQ3, 4.

Встановлення нових алелів змусило переглянути номенклатуру HLA, і тепер прийнято чотиризначне їх позначення (наприклад А0101 замість А1). В тих же випадках, коли виявлено декілька алелів, які за колишньою класифікацією кодували різні субтипи одного антигену (наприклад,

вHLA-A2 було визначено 12 таких субтипів), їх позначають як різні алелі, що мають загальні перші цифри. Наприклад, від HLA0201 до HLA0212 або від HLAB2701 до HLAB2707.

Якщо в результаті типування визначається тільки один антиген по якомусь локусу, то це є наслідком гомозиготності індивіда з даного гену. Отже, від батька і матері успадкована алель однаковою специфічності.

Вищевикладене стосується тільки класу I HLA, де поліморфним є тільки один ланцюг. У класі II HLA через можливий поліморфізм як бета, так і альфа генів, встановлені алелі позначають в залежності від ланцюга, що несе варіабельну ділянку ДНК, що визначає специфічність, наприклад DQA1-0501 і DQB1-0501.

Існує декілька методик проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).