Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

3.Другі МКАТ, мічені біотином, вносять по 100 мкл і інкубують зразки з ними протягом 1,5 годин при безперервному струшуванні при +18°С. Після інкубації розчин з осередків видаляють за допомогою піпетки. Осередки тричі промивають внесенням 300 мкл розчину для промивання в кожну з них. Залишки промивання видаляють.

4.Кон'югат стрептавідін-пероксидази, розведений 1:100 буфером, вносять в обсязі 100 мкл до осередку планшету і інкубують при +18°С і безперервному струшуванні протягом години. Після інкубації розчин з осередків видаляють. За 10-15 хв. до закінчення інкубації готують розчин тетраметілбензидіну. Осередки планшета, після видалення розчину, тричі промивають внесенням 300 мкл розчину для промивання і 3-5 разів дистильованою водою з подальшим видаленням її струшуванням планшету над раковиною. В результаті цих операцій формується «сендвіч», що складається з наступних шарів: фіксоване антитіло - зразок (цитокін), пов'язаний з ферментом антитіла.

5.Додають 200 мкл розчину тетраметілбензидіну. Інкубують протягом 20 хв. при кімнатній температурі в темряві. Зупиняють реакцію додаванням 50 мкл розчину 1Н сірчаної кислоти. Розщеплення субстрату ферментом призводить до зміни забарвлення першого. За зміною забарвлення субстрату дізнаються про присутність цитокіну, який був у зразку. Облік результатів, що визначають активність зв'язаної пероксидази, проводять з використанням автоматичного фотометра для мікропланшетів при довжині хвилі 492 нм, встановлюючи нульове поглинання по лунках зі стандартом без визначеного цитокіну в розчині. Кількісну оцінку результатів проводять методом побудови калібрувальної кривої, що відображає залежність оптичної щільності від концентрації антитіла. Чутливість методу при використанні вітчизняних тест-систем - 5 - 30 пг / мл.

Переваги імуноферментного методу: висока чутливість; можливість використання мінімальних обсягів досліджуваного матеріалу; стабільність при зберіганні всіх інгредієнтів, необхідних для проведення ІФА (до року і більше); простота проведення реакції; наявність як інструментального (в якісному і кількісному варіанті), так і візуального обліку; можливість автоматизації всіх етапів реакції; відносно низька вартість діагностичних наборів.

Вивчення експресії генів цитокінів. Цитокіни - сигнальні молекули імунної системи. Рівень експресії цих білків має важливе діагностичне значення для підбору імунокоригуючої терапії і прогнозу інтенсивності

іспрямованості імунної відповіді. Для того щоб визначити, які цитокіни

ів якій кількості синтезуються, широко застосовується метод ПЛР.

Полімеразна ланцюгова реакція - метод, що імітує природну реплікацію ДНК і дозволяє виявити кілька специфічних молекул ДНК в присутності мільйонів інших молекул. Метод заснований на багаторазовому виборчому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів в штучних умовах (in vitro). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і лише в тому випадку, якщо він присутній в досліджуваному зразку. За допомогою ПЛР ампліфікують відносно короткі ділянки ДНК. У звичайному ПЛР-процесі довжина копійованих ДНК-ділянок становить не більше 3000 пар основ. За допомогою суміші різних полімераз, з використанням добавок і за певних умов довжина ПЛР-фрагменту може досягати 20-40 тисяч пар нуклеотидів.

Проведення в лабораторії ПЛР-аналізу відбувається в три етапи: 1) виділення ДНК; 2) ампліфікація ДНК-фрагментів; 3) детекція ДНКпродуктів ампліфікації.

Виділення ДНК - це початковий етап проведення ПЛР-діагностики, суть якого полягає в наступному: лікар бере у пацієнта матеріал для дослідження і піддає його спеціальній обробці. В процесі обробки відбувається розщеплення подвійної спіралі ДНК на окремі нитки. У матеріал пацієнта додається спеціальна рідина, що розчиняє органічні речовини, які заважають «чистоті» проведення реакції. Таким чином видаляються ліпіди, амінокислоти, пептиди, вуглеводи, білки і полісахариди. В результаті утворюється ДНК або РНК.

В основі ампліфікації ДНК і відповідно в основі всього принципу ПЛР-реакції лежить природний для всього живого процес добудовування ДНК-реплікації ДНК, який здійснюється шляхом подвоєння одиничної ланцюжка ДНК.

Почавши з одного-єдиного фрагмента ДНК, лікар-лаборант копіює його і збільшує кількість копій в режимі ланцюгової реакції: після першого циклу у вас вже є 2 фрагмента, після другого циклу - 4, після третього - 8, після четвертого - 16, потім 32 , 64, 128, 256 ... З кожним циклом відбувається подвоєння числа копій і після двадцяти циклів рахунок вже йде на мільйони, а після тридцяти - на мільярди. Цикл триває лічені хвилини і зводиться до певної зміни температурного режиму в дуже невеликому хімічному реакторі. Тут в розчині в достатній кількості знаходяться всі потрібні компоненти синтезу, перш за все, нуклеотиди, а також проведені тонкі підготовчі хімічні операції для того, щоб з кожного готового відрізка ДНК відразу знімалася точна копія, потім з цієї копії - знову копія, в цьому і полягає розгалужена ланцюгова реакція.

Шляхом приєднання до ланцюга ДНК праймерів утворюються дві короткі, що складаються з двох ланцюгів ділянок ДНК, спіралі, які необхідні для синтезу майбутньої ДНК.

Синтез нового ланцюга відбувається шляхом добудовування кожної з двох ниток ДНК. Процес ампліфікації відбувається за допомогою специфічної ділянки - ДНК-полімерази, який називається лабораторним методом. Полімераза виступає в ролі каталізатора реакції і стежить за послідовним прикріпленням нуклеотидних підстав до зростаючого нового ланцюга ДНК.

Таким чином, ампліфікація ДНК являє собою багаторазове збільшення числа копій ДНК, які специфічні. Всі чисельні повторювані етапи ампліфікації відбуваються при різних температурах. Для проведення ПЛР-аналізу використовується спеціально програмоване обладнання - ПЛР-термостат або ампліфікатор, яке автоматично здійснює зміну температур. Ампліфікація проводиться за заданою програмою, що відповідає виду визначення інфекції. В залежності від програми і виду обумовленої інфекції процес автоматизованої ПЛР займає 2 - 3 год.

В процесі детекції продуктів ампліфікації проходить поділ отриманої суміші продуктів ампліфікації. До суміші додається спеціальні розчини, які наділяють фрагменти ДНК здатністю флюоресціювати - відбиватися оранжево-червоними смугами.

Аналіз поліморфізму генів цитокінів. Дослідження генів, які контролюють активність цитокінів, і є медіаторами запалення, - одна з важливих завдань у розкритті патогенетичних ланок ініціації та перебігу захворювань, виявлення на ранніх термінах схильності до захворювань. Знання їх ролі в патогенезі багатьох захворювань дозволяє, з одного боку, прогнозувати ризик розвитку патології або тяжкість її перебігу, з іншого - індивідуально підібрати специфічну терапію для конкретного пацієнта.

За експресією прозапальних цитокінів здійснюється постійний генетичний контроль. Розглянемо функціональний поліморфізм гена TNF-α. Ген TNF- α розташований на шостий хромосомі (6p21.3) в локусі, що кодує молекули головного комплексу гістосумісності першого (HLA-A, B, C) і другого класів (HLA-DP, DQ, DR). Розташування в середній частині генома визначає велику варіабельність локусу, зокрема, промоторна зона гена TNF-α включає вісім поліморфних ділянок з одиничними нуклеотидними замінами -1031T/C, -863C/A, -857C/T, -575G/A, -376G/A, -308G/A, -244G/A, -238G/A. Однак найбільш значимими для людини вважаються два. Це одиничні нуклеотидні заміни гуаніну на аденін в

положеннях: -308 (GRA) і -238 (GRA), які викликають зміни рівня продукції TNF-α, тобто є функціональними. Позиції -308 і -238 припадають на промотор, що позначається на можливості транскрипційних факторів зв'язуватися з цією частиною гена і, таким чином, впливати на швидкість транскрипції. Поліморфізм - 308 підвищує транскрипційну активність гена TNF-α і, відповідно, продукцію цитокіну. Найбільш активна транскрипція поліморфного гена TNF-α (-308*А) йде в макрофагах: в них вона в 5 разів вище, ніж транскрипція нормального гена -308*G. Враховуючи той факт, що макрофаги - основне джерело TNF-α, їх генетично обумовлена здатність до збільшеної продукції цього прозапального цитокіну може відбиватися на розвитку запальних та імунних реакцій організму.

Ще одною поліморфною ділянкою гена TNF-α, що впливає на продукцію цитокіну, є положення 238. Однак, в даному випадку заміна гуаніну на аденін веде не до підвищення, а до зниження продукції білка. Так, стимуляція клітин цільної крові ліпополісахаридом показала, що клітини з генотипом-238GA синтезують в 1,5 рази менше TNF-α, ніж клітини з генотипом-238GG.

При ревматоїдному артриті провідна роль у патогенезі належить прозапальним цитокінам - IL-1β і TNF-α. При дослідженні було виявлено, що пацієнти, які мають генотип-308G/A гену TNF-α, мають важчий перебіг ревматоїдного артриту, ніж ті, що несуть G/G генотип. У пацієнтів з алелем G/A зазначалися більш ранній початок захворювання, вища активність, більша кількість ерозій. У той же час, в інших популяціях хворих розглянутий алельних варіант гену TNF-α не впливав на тяжкість і перебіг ревматоїдного артриту і не був асоційований з цим захворюванням. При дослідженні поліморфізму гену IL1β в точці (+3953 RТ) 5-го екзону було виявлено, що генотип Т/T (А2А2 алель) асоційований з більш активним ревматоїдним артритом порівняно з генотипами C/C і C/T. З інших даних відомо, що наявність алелі Т в цій точці асоційоване з великим числом ерозій при ревматоїдному артриті і високою експресією гена in vitro.

Одним з найбільш негативних наслідків бактеріального інфікування організму є септичний шок. Основним ендогенним медіатором розвитку септичного шоку служить TNF-α. У високих концентраціях він здатний викликати активацію ендотелію, що приводить до розширення судин і падіння артеріального тиску, дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові (ДВЗ-синдрому), поліорганної недостатності, порушення терморегуляції, що в сумі веде до летального результату. При генотипуванні дітей було показано, що присутність хоча б однієї копії високоак-

тивного алеля-308*А в генотипі дитини підвищує ймовірність летального результату в 2,5 рази. Смертність дітей з поліморфним генотипом-308 (AG, AA) була в 3 рази вище в порівнянні з носіями гомозиготного варіанта (-308 GG) гена TNF-α. Те ж стосується і астми: заміна G на A в позиції-308 пов'язана з підвищеним виробленням цього цитокіну, що пов'язане з ризиком розвитку аутоімунної патології. Також виявлений взаємозв'язок підвищеної частоти алеля IL-10-592А з тяжкістю сепсису, розвитком поліорганної недостатності та високою ймовірністю летального результату.

У ВІЛ-інфікованих хворих спостерігається ряд відмінностей з контрольною групою здорових людей в частоті сполучень алельних варіантів генів цитокінів, пов'язаних з появою A/A гомозиготного варіанту гена IL-10 (RR = 2,36), не виявленого у здорових осіб, і відсутністю гомозиготного A/A варіанту гену TNF-α (RR = -12,25), виявленого у 4% здорових жінок. Частота A/G варіанту гену TNF-α в чотири рази вища у хворих (RR = 4,67) за рахунок зниження частоти обох гомозиготних варіантів.

Ген IL1RN кодує IL-1RA і локалізований в 2 хромосомі. Носійство алеля IL1RN*2 пов'язано з підвищеним рівнем циркулюючого IL-1RA і рівнем експресії мРНК в ході запалення. Вплив поліморфізму генів IL1B (кодує IL-1β) і IL1RN на характер запалення можна описати у вигляді наступних тенденцій: носійство немутантів варіантів цих генів визначає адекватну продукцію відповідних білків і регуляцію функціонування системи IL-1; у носіїв генетично зумовленої переваги в сторону продукції IL1β запалення протікає більш гостро, у носіїв генетично зумовленої переваги в бік вироблення IL-1RA запальний відповідь більш тривалий, що може бути причиною хронізації запалення. Рівень IL-1RA в плазмі крові скоординований і спільно регулюється генами IL1B і IL1RN, а носійство IL1RN*2 відповідальне за підвищений рівень як циркулюючого IL-1RA, так і IL-1β, збільшена активація експресії і продукції, яка є наслідком надлишкового вироблення IL-1RA. Згідно з цією версією, при реалізації запальної відповіді у носіїв генетично зумовленої переваги в бік вироблення IL-1RA, кількість цього білка більша, ніж необхідно для адекватної реалізації запалення, що викликає компенсаторний виробіток ще більшої кількості IL-1β. При цьому і IL-1RA у відповідь виробляється теж більше. Таким чином, носійство поєднань генів IL1B і IL1RN, що визначають перевагу у бік вироблення IL-1RA, призводить до більш тривалої запальної відповіді.