Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія
ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ |
101 |
|
|
Оскільки в даний час багато лабораторій оснащені стриповими фотометрами, можлива постановка даної реакції мікрометодом. Для цього досліджувану сироватку розводять боратний буфером в 3 рази. Розведення сироватки виконують наступним чином. У лунку планшета для імунологічних реакцій вносять 0,05 мл сироватки крові і 0,1 мл буфера. В паралельні лунки другого планшета вносять в першу - 0,25 мл буфера, у другу - 0,25 мл розчину поліетиленгліколю. Потім в обидві лунки цього планшета вносять по 0,05 мл розведеної сироватки з першого планшета. Планшет витримують 1:00 при кімнатній температурі. На вертикальному фотометрі з використанням світлофільтра 450 нм визначають екстинції. Обчислюють різницю показників сироватки крові з поліетиленгліколем і сироватки з буфером і множать на 100, що і є величиною ЦІК, вираженої в одиницях оптичної щільності.
Вміст ЦІК у сироватці в нормі - 30-90 МО/мл.
Клінічне значення. ЦІК - комплекси, що складаються з антигену, антитіл і пов'язаних з ними компонентів комплементу С3, С4, Clq. У нормі імунні комплекси, що утворилися в кровотоці, фагоцитуються і руйнуються як фагоцитами, так і печінкою. Однак при збільшенні їх розміру (при надлишку антигену і наявності в їх структурі IgM, Clq-ком- понента комплементу) комплекси можуть відкладатися в периваскулярному просторі і кірковому шарі нирок, викликаючи активацію комплементу і запальних процесів. Патологічні реакції на імунні комплекси можуть бути обумовлені підвищенням швидкості їх утворення над швидкістю елімінації, дефіцитом одного або декількох компонентів комплементу або функціональними дефектами фагоцитарної системи. Визначення рівня імунних комплексів в сироватці крові має важливе значення в діагностиці гострих запальних процесів і алергічних реакцій 3-го типу, при яких рівень ЦІК підвищується, а також в оцінці ефективності проведеного лікування. Підвищення рівня ЦІК в крові характерно для:
-гострих бактеріальних, грибкових, паразитарних і вірусних інфекцій;
-аутоімунного захворювання, колагенозів, ревматизму, гломерулонефриту, алергічних альвеолітів, васкулітів, феномена Артюса;
-імунокомплексних захворювань, сироваткової хвороби;
-алергічних реакцій 3-го типу.
Визначення гемолітичної активності комплементу. Уніфікований метод визначення гемолітичної активності комплементу по 50% гемолізу.
102 |
ІМУНОЛОГІЯ |
|
|
Принцип методу. Активність системи комплементу - гемолітична здатність сироватки крові людини лізувати еритроцити тварин. Комплемент, що міститься в досліджуваній сироватці, викликає гемоліз сенсибілізованих еритроцитів барана в присутності сироватки кролика, імунізованого баранячими еритроцитами (гемолітична сироватка).
Активність комплементу виражають в гемолітичних одиницях. За одну 50% гемолітичну одиницю комплементу (СН50) приймають таку його кількість, яка викликає гемоліз 50% 0,5 мл стандартної суспензії сенсибілізованих еритроцитів барана при 37°С за 45 хв.
Спочатку гемолітична активність комплементу визначалася мінімальною кількістю сироватки, яка здатна викликати лізис 100% певної кількості еритроцитів барана. Проте вивчення літичної активності комплементу в залежності від його кількості виявило сигмоідальний характер кривої кореляції, причому повний гемоліз настає в широкій зоні верхньої частини кривої, тому гемолітичну активність комплементу виражають в СН50 - одиницях оцінки загальної (сумарної) функціональної активності ранніх (C1, C4, C2) і термінальних (С3-С9) компонентів системи комплементу, активованої за класичним шляхом.
В нормі 1СН50 становить 50-70 СН50/мл.
Реактиви: 1. Гемолітична сироватка (гемолізини). Випускаються стандартні серії препарату в ампулах з титром гемолітичної сироватки, зазначеним на етикетці. Такі сироватки мають тривалий термін придатності при зберіганні при температурі 2-8 ° С. 2. Еритроцити барана. 3. Веронал-медіналовий буфер. Склад буфера (в грамах): 85 NaCl, 5,75 - веронал; 3,75 - мединал; 0,22 - СаСl2х2Н2О, 1 - Mg5Cl2х6H2O, рН 7,3-7,8 (5,75 г веронала розчиняють в 500 мл гарячої дистильованої води, суміш охолоджують до +20°С, додають інші компоненти і доводять дистильованою водою до об'єму 2 л. Буфер зберігають при температурі 3-5°С).
Хід визначення
Підготовчий етап:
1.Приготування буфера - в день постановки методики до однієї частини буферного розчину додати 4 частини дистильованої води. Розведений буферний розчин придатний протягом 12 год.
2.Обробка досліджуваної сироватки хворого - кров хворого, узяту з вени в кількості 2-3 мл, залишають на 2 год. при кімнатній температурі, потім центрифугують 10-15 хв. при 1500 об/хв. Сироватку обережно виділяють і дослідження проводять в той же день.
ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ |
103 |
|
|
Приготування гемолітичної системи. Гемолітична система - це суміш рівних обсягів розведеної до триразового титру гемолітичної сироватки і 3% суспензії еритроцитів барана від обсягу щільного осаду (100 мл 3% суспензії і 100 мл розведеної гемолітичної сироватки: 0,1 мл гемолітичної сироватки і 99,9 мл ізотонічного розчину хлориду натрію).
Приготування 3% суспензії еритроцитів барана: дефібриновану кров барана відмивають 3 рази 5-10-кратними обсягами ізотонічного розчину хлориду натрію, який після третього відмивання еритроцитарної суспензії повинен бути безбарвним. З щільного осаду еритроцитів готують 3% (за об'ємом) суспензію еритроцитів барана у фізіологічному розчині.
Стандартизація суспензії еритроцитів барана. Стандартизацію суспензії еритроцитів барана здійснюють методом фотоколориметрування. Для фотоколориметрування застосовують зелений світлофільтр. 1 мл 3% суспензії відмитих еритроцитів барана додають в пробірку до 9 мл дистильованої води, отриману лізовану кров вливають в 10-мл кювету, в інші дві кювети (такого ж об'єму ) наливають розчин (суміш з 1 мл ізотонічного розчину і 9 мл дистильованої води).
У лівий кюветоутримувач ставлять кювету з розчинником, в правий - кювету з лізованою кров'ю. Певної концентрації еритроцитів барана відповідає певний показник шкали оптичної щільності. Якщо 3% завись еритроцитів барана приготовлена правильно, то шкала оптичної щільності лізата еритроцитів показує 0,4.
Якщо показник оптичної щільності менше 0,4, то до приготовленої суспензії еритроцитів барана слід додати відповідну за графіком кількість еритроцитів. Якщо ж показник оптичної щільності вище 0,4, то до приготовленої суспензії еритроцитів барана слід додати відповідну кількість ізотонічного розчину хлориду натрію (рис. 6).
Після приготування 3% суспензії еритроцитів барана готують гемолітичну сироватку.
104 |
ІМУНОЛОГІЯ |
|
|
Рис. 6. Крива стандартизації суспензії еритроцитів барана за даними фотоколориметрії [30]
Примітка: Кювета 10 мл. Світлофільтр зелений. I - суспензія еритроцитів барана (%), II - еритроцити барана (мл), які потрібно додати до 100 мл суспензії, щоб отримати 3% завись, III - ізотонічний розчин хлориду натрію (мл), який потрібно додати до 100 мл суспензії, щоб отримати 3% завись.
Розведення гемолітичної сироватки. Перед дослідом ампулу розкривають, ліофільний препарат, що міститься в ній, розводять стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію згідно інструкції. Гемолітичну сироватку беруть в розведенні, яке в 3 рази перевищує її вихідну концентрацію. Так, якщо титр гемолітичної сироватки дорівнює 1:1200,
ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ |
105 |
|
|
готують розведення 1:400. Виходячи з необхідного, для постановки реакції обсягу гемолітичної системи відмірюють потрібну кількість гемолітичної сироватки.
Після цього ампулу запаюють і залишок гемолітичної сироватки зберігають до наступного досліду в холодильнику при 4-8°С. Тільки після приготування 3% суспензії еритроцитів барана і розведення по титру гемолітичної сироватки можна приступити до приготування гемолітичної системи.
Сенсибілізація еритроцитів барана. До 1 обсягу суспензії еритроцитів барана додають рівний об'єм розведеної гемолітичної сироватки, що містить 4 гемолітичні одиниці (розведення гемолітичної сироватки 1:400). Змішування гемолітичної сироватки (0,1 мл і 99,9 мл ізотонічного розчину натрію хлориду) з еритроцитами барана виконують швидко, причому гемолітичну сироватку домішують до суспензії еритроцитів, а не навпаки. Суміш витримують при температурі 37°С в термостаті 30 хв. для сенсибілізації еритроцитів. Під час інкубації суміш кілька разів струшують. Сенсибілізовані еритроцити повинні бути використані в той же день, до використання їх зберігають при 4°С. Сенсибілізовані еритроцити барана називаються гемолітичною системою, яку використовують для титрування комплементу в пробірці.
Титрування комплементу. Досліджувану сироватку, розведену 1:10 буферним розчином, розливають у 2 пробірки: 0,1 і 0,25 мл. Розлиту сироватку (1:10) доводять веронал-медіналовим буфером до обсягу 1,5 мл. Потім в кожну пробірку додають 1,5 мл стандартизованої гемолітичної системи.
Одночасно з дослідними пробірками ставлять контроль на відсутність гемолізу сенсибілізованих еритроцитів: 1,5 мл гемолітичної системи та 1,5 мл веронал-медіналового буфера. Пробірки струшують і поміщають в термостат при температурі 37°С на 45 хв. Після інкубації їх охолоджують при температурі 2-4°С протягом 18-19 год. На наступний день проводять фотоколориметрування надосадової рідини з кожної пробірки (проти ізотонічного розчину хлориду натрію або дистильованої води в контрольній кюветі). Для врахування ступеня гемолізу необхідно використовувати шкалу стандартних розведень лізованих еритроцитів по А. П. Коннікова, яку готують для кожної партії еритроцитів і гемолітичної сироватки (табл. 16).