Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

кон’югатів (анти-A, анти-M, анти-G). Компоненти, що не зв’язалися, відмиваються, активність ферменту в складі імунних комплексів визначають за допомогою субстрат–хромогенної суміші. Інтенсивність зафарбовування хромогену зворотно-пропорційна кількості антитіл в зразку.

Склад набору: 1. Планшет полістироловий з іммобілізованим антигеном (1-4 стрипи – Ig A, 5-8 – IgM, 9-12 - IgG) (1 шт.); 2. Фосфатно-соль- овий буфер (ФСБ), 30 мл (1 фл.); 3. Стандартний зразок, 30 мкл (1 уп.);

4.Кон’югати, мічені пероксидазою (анти-A, анти-M, анти-G) (1 набір);

5.Цитратно-фосфатний буфер, 1.5 мл (1 фл.); 6. Розчин субстрату, 1.5 мл (1 фл.); 7. Зупиняючий розчин, 11 мл (1 фл.).

Досліджуваний матеріал. Використовують свіжу, вільну від домішок сироватку. Зберігають зразки не більше 72 годин при +2 – (+10)°С. Довгострокове зберігання допускається в замороженому вигляді при температурі мінус 20°С. Повторні замороження та розтавання не рекомендуються. Використання гемолізованих та ліпідемічних зразків не рекомендуються.

Підготовка реагентів

1.Перед постановкою дослідження набор витримують при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.

2.Готують необхідну кількість розчину ФСБ, для чого розводять його в 10 раз дистильованою водою. При випаданні солі в осад в концентраті необхідно прогріти його при 30-40°С до повного розчинення осаду. Приготовлений розчин використовують для розведення сироваток, кон’югату та промивання планшетів. Отриманий розчин стабільний протягом 2-х діб при кімнатній температурі чи 10 діб у холодильнику (+2 – (+10)°С).

3.Підготовка стандартного та досліджуваних зразків: перед дослідженням стандарт та сироватки розводять ФСБ в 200 разів (5 мкл в 1 мл).

4.Підготовка робочих розчинів кон’югату: анти А-ПХ - 20 мкл кон’югату розводять у 5 мл ФСБ; анти М-ПХ - 100 мкл кон югату розчиняють у 5 мл ФСБ; анти G-ПХ – 50 мкл кон’югату розводять у 5 мл ФСБ (ПХ – пероксидаза хріну).

При постановці реакції тільки на частині планшету кількість розчину кон’югату зменшується пропорційно. Робочий розчин кон’югату готують безпосередньо перед використанням!

5.Підготовка субстратної суміші: до 9 мл дистильованої води добавляють 1 мл цитратно-фосфатного буферу та 1 мл розчину субстрата. При постановці реакції тільки на частині планшету кількість субстратної суміші зменшується пропорційно. Робочий розчин субстратної суміші готують безпосередньо перед використанням!

Проведення дослідження:

1.Внести в лунки по 100 мкл розчину ФСБ (холосте випробування), стандартного та досліджуваних зразків в 2-х повторах.

2.Внести по 100 мкл відповідних кон’югатів.

3.Інкубувати стрипи 60 хв. при кімнатній температурі, періодично струшуючи або на шейкері.

4.Промити планшет 4-5 разів ФСБ, добавляючи в лунки по 250 мкл розчину.

5.Внести по 100 мкл субстратної суміші.

6.Інкубувати в захищеному від світла місці 15-20 хвилин в залежності від ступеню розвитку окрасу.

7.Внести по 100 мкл зупиняючого розчину.

8.Не більше як через 5 хвилин виміряти оптичну щільність на аналізаторі імуноферментному при довжині хвилі 450 нм.

Оцінка результатів дослідження. Вимірюють оптичну щільність (ОЩ) в усіх лунках і проводять розрахунки, використовуючи зворотньопропорційну залежність:

де ОЩст – оптична щільність стандартного зразку, Сст – концентрація імуноглобуліну в ньому, ОЩх – оптична щільність досліджуваного зразку, Сх – концентрація імуноглобуліну в досліджуваному зразку.

Вміст імуноглобулінів в стандартному зразку: IgA - 2,31 г/л, IgM - 1,29 г/л, IgG - 11,49 г/л.

Очікувані коливання ОЩ стандартного зразку для Ig A не нижче 0,3 оптичних одиниць (ОО), Ig M не нижче 0,3 ОО, Ig G не нижче 0,3 ОО.

Нормальні показники. Ґрунтуючись на результатах досліджень, проведених лабораторіями, рекомендуємо користатися нормами, приведеними нижче. Концентрація імуноглобулінів в нормі:

Ig A - 1,25 – 2,5 г/л, Ig M - 0,65 - 2 г/л, Ig G - 7,5 - 18 г/л.

Вимоги безпеки: 1. Набор призначений тільки для діагностики in vitro. Категорично забороняється піпетування ротом. 2. Засобами індивідуального захисту при роботі з наборами є марлеві пов’язки та гумові рукавички. Знезараження сироваток проводити згiдно з наказом МОЗ СРСР №408 вiд 29.12.89 р. «О мерах по снижению заболеваемости вирусными гепатитами в стране».

Умови транспортування та зберігання: 1 Набори транспортують всіма видами закритого транспорту при температурі від +2 до +10°С. Допускається транспортування при температурі до +37°С не більше 72

годин. 2 Набори повинні зберігатися при температурі від +2 до 10°С. Не допускається замороження!

Гарантійний термін зберігання становить 6 місяців від дня виготовлення набору. Після закінчення терміну зберігання набори підлягають повторному контролю якості.

Термін придатності стрипів після розкриття пакету становить 1 місяць при температурі +2 – (+10)˚С. Невикористані стрипи зберігають у щільно закритому пакеті. Перед постановкою дослідження набор витримують при кімнатній температурі протягом 30 хв.

Кількісне визначення імуноглобулінів методом радіальної імунодифузії по Манчіні. Принцип методу. Визначення IgA, IgM, IgG методом радіальної імунодифузії в гелі агарози по Mancini et al засновано на тому, що зразки досліджуваних сироваток вміщують у лунки агару, який містить антитіла до Ig одного з класів IgА, IgМ, IgG у відомій концентрації. Імуноглобуліни, дифундуючи з лунок в агар, при взаємодії з відповідними антитілами будуть утворювати кільця преципітації, розмір яких знаходиться в тісній залежності від вмісту в сироватці обстежуваного Ig того чи іншого класу.

Матеріали і устаткування: 1. Скляні пластини 9х12 см 2. П-образна рамка 120х90х8 мм для полегшення заливки скла агаром. 3. Водяна баня на 50-60°С. 4. Пастерівські піпетки з відтягнутим кінцем. 5. Волога камера. 6. Вимірник. 7. Калібрувальна лінійка. 8. Комерційні набори для визначення концентрації імуноглобулінів. 9. 0,2 М вероналовий буфер. 10. Реактив для забарвлення преципітату. 11. Пробійник круглий діаметром 1.5-2.0 мм для вирізання лунок в гелі агарози.

Опис методу. Приготування вероналового буферу: 1,84 г вероналу і 0,34 г їдкого натру розчиняють в 200 мл дистильованої води.

Приготування гелю агарози: агарозу з набору для визначення імуноглобулінів в сироватці крові у кількості 3,6 г висипають в 200 мл вероналового буферу, підігрітого до температури 50-60°С, після чого кип'ятять впродовж 10-15 хв. на водяній бані до повного розплавлення агару і отримання прозорого гелю. Розплавлений агар фільтрують через вату і розливають по 21 мл в підігріті скляні циліндри, які закривають пробками і поміщають на водяну баню з температурою 56-58°С. Ампулу моноспецифічної сироватки з робочим титром 1:20-1:30 розводять в 1 мл

вероналового буфера, виливають у відповідний циліндр, перемішують і 10-15 хв. витримують на водяній бані.

Скляні пластини розміром 9х12 см протирають ефіром, на склі поміщають обмежувальну рамку (за відсутності рамки краю можна обробити парафіном). Підготовлені таким чином пластини підігрівають і поміщають на строго горизонтальну поверхню. На середину пластини з циліндра швидко виливають розплавлений агар, що містить моноспецифічну сироватку. Гель за допомогою скляної палички швидко

ірівномірно розподіляють по усій поверхні стекла, бульбашки повітря ретельно видаляють. Пластину з гелем залишають на горизонтальній поверхні до повного затвердіння агару.

За допомогою круглого штампу по трафарету в гелі вирізують лунки. Відстань від краю скла до лунок і між лунками повинно бути не менше 10 мм. На одному склі розміром 9х12 см можна розмістити до 48 лунок. Агар з лунок видаляють пастерівською піпеткою, сполученою з вакуумним або водоструминним насосом. Підготовлені пластини при необхідності можна зберігати у вологій камері при температурі 4°С.

Досліджувану сироватку за допомогою пастерівської піпетки з тонко відтягнутим кінцем вносять в лунки до зникнення увігнутого меніска. Кожну сироватку вносять в агарові лунки, що містять ту або іншу моноспецифічну сироватку. У 4 лунки агарової пластини вносять цілісну і розведену в 2, 4, 8 разів стандартну (еталонну) сироватку з відомим змістом імуноглобулінів усіх класів. Ампула із стандартною сироваткою входить в кожен набір моноспецифічних сироваток. Після внесення досліджуваних сироваток пластини поміщають у вологу камеру, в якості якої можна використовувати ексикатор з налитою на дно водою або інший відповідний посуд з кришкою і інкубують впродовж 24 годин (для визначення IgA

іIgG) або 48 годин (для визначення IgM і IgD).

Після інкубації пластини витягають з вологої камери і забарвлюють відповідним барвником: бромфеноловим синім (склад фарби: бромфеноловий синій 0.5 г, свинець оцтовокислий 4% водною розчин - 10 мл, оцтова кислота крижана 20 мл, вода дистильована до 1 л), амідо чорний 10 В (склад фарби: 1% амідо чорного в 7% водному розчині оцтової кислоти).

Облік результатів. Для оцінки результатів реакції вимірюють діаметр кілець преципітації, що утворилися навкруги лунок. Потім на напівлогарифмічному папері наносять на осі абсцис діаметри кілець стандартної сироватки, а по осі ординат - відому концентрацію кожного класу іму-

ноглобулінів в г/л і будують калібрувальний графік, за допомогою якого обчислюють вміст імуноглобулінів в кожній досліджуваній сироватці.

У нормі в сироватці міститься 0,65-1,65 г/л IgM; 7,50-15,45 г/л IgG; 1,25-2,5 г/л IgA. У таблиці 13 і 14 приведені норми показників для цього методу.

Таблиця 13 Концентрація імуноглобулінів дорослої людини

в сироватці крові в нормі

Клінічне значення. Імуноглобуліни є продуктами секреції В-клітин на кінцевій стадії їх диференціювання, тобто плазматичних клітин. Рівень сироваткових Ig відображує функціональний стан В-клітинної ланки імунної системи у відповідь на стимуляцію організму антигенними подразниками. Підвищення рівня характерне для гострих та хронічних запальних процесів, аутоімунних захворюваннях та ін. Дефекти, пов’язані з порушенням метаболізму імуноглобулінів, спостерігаються при багатьох захворюваннях. Зниження рівня імуноглобулінів свідчить про недостатність гуморальної ланки імунітету, порушення їх синтезу або посилення катаболізму, адсорбція на імунних комплексах.