Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

Підвищення концентрації IgА спостерігається при: гострій та хронічній бактеріальній, грибковій, паразитарній інфекції, хронічних захворюваннях печінки, цирозі, ревматоїдному артриті, СЧВ, хронічному лімфолейкозі, мієломній хворобі, моноклональній гамапатії, хворобі Вальденстрема, ендотеліомі, остеосаркомі, кандидозі, муковісцидозі, захворюваннях дихальних шляхів.

Зменшення концентрації IgА спостерігається при: фізіологічній гіпогамаглобулінемії у дітей (у віці 3 - 5 міс.), вродженій гіпогамаглобулінемії або агамаглобулінемії, новоутвореннях імунної системи, лікуванні цитостатиками і імунодепресантами, станах після видалення селезінки, кишкових та ниркових синдромах втрати білку, гострих вірусних, хронічних бактеріальних інфекціях.

Підвищення концентрації IgM спостерігається при: гострих та хронічних бактеріальних, грибкових, паразитарних інфекціях, гострих вірусних гепатитах, цирозі, ревматоїдному артриті, СЧВ, гострому та хронічному лімфолейкозі, мієломній хворобі, макроглобулінемії Вальденстрема, ендотеліомі, остеосаркомі, кандидозі, муковісцидозі, захворюваннях дихальних шляхів.

Зменшення концентрації IgM спостерігається при: фізіологічній гіпогамаглобулінемії у дітей (у віці 3 - 5 міс.), вродженій гіпогамаглобулінемії або агамаглобулінемії, новоутвореннях імунної системи, лікуванні цитостатиками і імунодепресантами, опроміненні іонізуючою радіацією, станах після видалення селезінки, кишкових та ниркових синдромах втрати білку, хронічній вірусній інфекції, недостатності гуморальної ланки імунітету.

Підвищення концентрації IgG спостерігається при: гострих та хронічних бактеріальних, грибкових, паразитарних інфекціях, гострих та хронічних захворювання печінки, цирозі, вірусному гепатиті, автоімунних захворюваннях, ревматоїдному артриті, СЧВ, саркоїдозі, муковісцидозі, хронічному лімфолейкозі, мієломній хворобі, інфекційному мононуклеозі, моноклональній гамапатії, хворобі Вальденстрема, реконвалесценції первинної бактеріальної інфекції, при гострому періоді повторної інфекції, СНІД.

Зменшення концентрації IgG спостерігається при: фізіологічній гіпогамаглобулінемії у дітей (у віці 3 - 5 міс.), вродженій гіпогамаглобулінемії або агамаглобулінемії, новоутворенні імунної системи, лікуванні цитостатиками і імунодепресантами, станах після видалення селезінки, кишкових та ниркових синдромах втрати білку, при хронічній вірусній інфекції, гемоглобінопатії.

Визначення загального IgE в сироватцi кровi імуноферментним методом. Принцип визначення. У наданiй тест-системi використовується принцип двосайтового (сендвiч) iмуноферментного аналiзу. У лунки мiкропланшета, на поверхнi якого адсорбованi специфiчнi анти-IgЕ-епсiлон- антитiла, вносять дослiджуваний зразок. Антиген з зразка зв'язується з антитiлами на поверхнi лунки. Незв'язаний матерiал видаляється вiдмивкою. У лунку вносять інші антитiла проти iншого епiтопу IgЕ, мiченi пероксидазою. Пiсля повторної вiдмивки активнiсть ферменту, зв'язаного на поверхнi лунки мiкропланшету, проявляється i вимiрюється додаванням хромоген-субстратної cумiшi, стоп-розчину та фотометрiєю при 450 нм. Iнтенсивнiсть кольорової реакції прямо пропорцiйна кiлькостi антигену у зразку.

Склад набору: 1. Стрипи для визначення загального IgE імуноферментним методом (Заг. IgЕ IФА), 8х12 лунок (1 шт.); 2. IФА буфер синiй, 6 мл (1 фл.); 3. Набiр калiбраторiв та контролiв, по 0.5 мл (всього калiбраторiв: 0, 50, 200, 500, 1000 МОд/мл; та 1 контрольний зразок); 4. Концентрат вiдмиваючого розчину, 22 мл (1 фл.); кон'югат, 11 мл (1фл.); 5. Розчин субстрату, 11 мл (1 фл.); 6. Зупиняючий розчин, 11 мл (1 фл.).

Важливі зауваження по збереженню реагентів і виконанню тесту:

1.Не змішуйте і не використовуйте в одній постановці реагенти різних серій.

2.Після використання реагенту негайно закривайте кришку флакона чи пробірки. Увага: закривайте кожен флакон своєю кришкою.

3.Усі компоненти набору повинні зберігатися в холодильнику (+2- (+10° С). Не заморожуйте набір.

4.Після розкриття пакету ретельно заклейте лунки, що залишилися, стрічкою для заклеювання, щоб запобігти впливу вологи пiд час зберігання.

5.Під час всіх інкубацій необхідно заклеювати планшет клейкою стрічкою. Не допускайте пересихання лунок мікропланшета між стадіями постановки.

6.Усі проби і стандарти бажано ставити в двох паралелях (повторах).

7.Досліджувані сироватки повинні бути ретельно відцентрифуговані. Не використовуйте мутні, хильозні та гемолітичні зразки.

8.Якщо аналіз виробляється не в день узяття крові, сироватку варто зберігати при -20°С. Повторне заморожування-відтавання не допускається.

9.Відмивання мікропланшета може проводитися як вручну, так

і з використанням автоматичних пристроїв. Вносити по 250 мкл відмиваючого розчину в лунки при кожному відмиванні. Затримка при відмиванні («замочування») не потрібна. Після закінчення ручного відмивання різко перегорнiть мікропланшет на фільтрувальний папір для видалення залишків буфера.

10. Вимірюйте оптичну щільність протягом не більш 15 хвилин після зупинки реакції із субстратом

Підготовка реагентів

1.Усі реагенти, включаючи необхідне число стрипів, перед використанням повинні бути доведені до кімнатної температури (+20-(+25)°С).

2.Приготуйте відмиваючий розчин: для цього концентрат, розбавте 10-кратним об’ємом дистильованої води в чистому посуді. Отриманий розчин стабільний протягом 5-х діб при кімнатній температурі чи 30 діб

ухолодильнику (+2 -(+10)°С).

Проведення аналiзу:

1.Помістiть у рамку потрібну кількість стрипів - зразки в 2 повторах та 12 лунок для калiбраторiв та контрольних зразкiв.

2.Внесiть у лунки по 50 мкл синього IФА буфера.

3.Внесiть у лунки по 50 мкл калiбратора або дослiджуваного зразка.

4.Iнкубуйте 30 хвилин при температурi 37°C .

5.Вiдмийте стрипи 3 рази відмиваючим розчином.

6.Внесiть у лунки по 100 мкл розчину кон'югата.

7.Iнкубуйте 30 хвилин при температурi 37°С.

8.Вiдмийте стрипи 5 разiв вiдмиваючим розчином.

9.Внесiть у лунки 100 мкл розчину субстрата.

10.Iнкубуйте 15 хвилин при температурі 20-25°C.

11.Внесiть у лунки 100 мкл зупиняючого розчину.

12.Визначте оптичну щільність у лунках на фотометрі при довжині хвилі 450 нм. Бланк фотометра виставляйте проти нульового калібратора Нормальні величини: ґрунтуючись на результатах досліджень, проведених лабораторiями, рекомендуємо користатися нормами, приведеними нижче (табл. 15). Разом з тим, відповідно до правил GLP (Гарної лабораторної практики), кожна лабораторія повинна сама визначити для себе

параметри норми, характерні для обстежуваної популяції.

Таблиця 15

Одиниці виміру загального IgE в сироватцi кровi в залежності від віку

Перехід в додаткові одиниці 1 МО/мл = 2,15 пг/мл Приклад калібровочної кривої (вісь Х – конц. МО/мл; вісь У – ОЩ)

(рис. 5).

Рис. 5. Калібровочна крива для виміру вмісту загального IgE в сироватцi кровi

Примітка: вісь Х – конц. МО/мл; вісь У – ОЩ.

Очікувані коливання контрольного зразка: 97 - 125 МО/мл. Вимоги безпеки: дивись вище.

Умови транспортування: дивись вище. Гарантії виробника: дивись вище.

Клінічне значення. Основна біологічна роль IgЕ - здатність зв'язуватися з поверхнею тучних клітин і базофілів людини. IgЕ бере участь в алергійних реакціях I (негайного) типу та у захисному протигельмінтному імунітеті, що обумовлено існуванням перехресного зв'язування між IgE і антигеном гельмінтів. Останній проникає через мембрану слизової

ірозміщується на тучних клітинах, викликаючи їх дегрануляцію. Медіатори запалення підвищують проникність капілярів і слизистої, у результаті чого IgE і лейкоцити виходять із кровотоку. До гельмінтів покритим IgE приєднуються еозинофіли, що викидають зміст своїх гранул і таким засобом вбивають гельмінти. Показання до визначення загального IgE: атопічні хвороби, алергійний риніт, атопічна бронхіальна астма, атопічний дерматит, алергійна гастроентеропатія, анафілактичні хвороби, системна анафілаксія, кропивниця - ангіоневротичний набряк, алергійний бронхопульмональний аспергільоз, гельмінтози, гіпер-IgE синдром (синдром Джоба), селективний IgE дефіцит, тимусна аплазія (синдром Ді-Джорджи), IgE–мієлома, реакція "трансплантат проти хазяїна" і ін.

Визначення рівня циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) в сироватці крові. Процеси аутосенсибілізації супроводжуються накопиченням циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), у зв'язку з чим визначення їх змісту є важливим етапом оцінки імунного статусу.

Матеріали та обладнання: 1. Сироватка крові (досліджувана). 2. Буфер боратний. 3. Поліетиленгліколь (мол. М. 6000). 4. Пробірки. 5. Центрифуга високошвидкісна типу Т-24. 6. Спектрофотометр.

Опис методу. Приготування 0,1 М боратного буфера: 3,410 г борної кислоти і 4,275 г тетраборату натрію змішують, переносять в мірну колбу

ідоводять до 1 л дистильованою водою, рН 8,4.

Сироватку крові в обсязі 200 мкл змішують з 5 мл 0,1 М боратного буфера. 4 мл суміші доливають до 4 мл 7% розчину поліетиленгліколю, приготовленого на 0,1 М боратному буферному розчині. Пробу інкубують 18-20 год. при температурі +4°С. Після інкубації суміш центрифугують при 2000 об/хв. протягом 10 хв. Надосадову рідину видаляють, препарат двічі відмивають 7% розчином поліетиленгліколю на 0,1 М боратному буфері і розчиняють в 5 мл 0,1 N розчину їдкого натра.

Облік результатів. Рівень циркулюючих імунних комплексів визначають за допомогою спектрофотометра при довжині хвилі 280 нм і виражають в одиницях оптичної щільності.