Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

ратів в концентраціях, близьких до фізіологічних, наприклад з левамізалом, теофіліном, Т-активіном, іншими імунокоригуючими препаратами;

3) інкубація клітин з різними дозами цих же препаратів.

Активацію T-лімфоцитів зазвичай оцінюють за наступними показниками:

•проліферація;

•вироблення цитокінів - інтерлейкінів-2 -4, -5, інтерферону- , чинника некрозу пухлин;

•експресія маркерів активації - CD25 і антигенів HLA класу II;

•цитотоксичність.

Дослідження функціональної активності фагоцитів. Виділення лейкосуспензії для постановки реакції фагоцитозу і нітросинього тетразолієвого тесту здійснюють з гепаринізованої крові.

Матеріали і устаткування: 10 % розчин медичного желатину; гепарин; середовище 199 або розчин Хенкса; 0,83 % розчин хлористого амонія; центрифуга з бакет-ротором; термостат; мікроскоп; камера Горяєва; силіконізовані пробірки.

Опис методу. Венозну кров в об'ємі 2-3 мл набирають в пробірку з гепарином в співвідношенні 10-20 Од гепарину на 1 мл крові. У кров додають 10 % розчин желатину в пропорції - на 1 мл крові 0,1 мл желатину і поміщають в термостат на 30-40 хв. при 37°С. Після відстоювання надосад, що складається з лейкосуспензії вносять в окрему пробірку і додають 0,83 % розчин хлористого амонія для лізування домішки еритроцитів. Далі лейкосуспензію тричі відмивають середовищем 199 або розчином Хенкса в центрифузі по 5-10 хв. при прискоренні 100-200 g (500-1500 об/хв.). Осад лейкоцитів ресуспендуют в середовищі 199 і доводять концентрацію до 5х106 в мл Усі маніпуляції з клітинами з метою скорочення втрат роблять в силіконізованому посуді.

Дослідження фагоцитарної активності лейкоцитів крові. Матеріали і устаткування: монодисперсні частки латексу; метанол; фарба по Романовському-Гімзе; предметне скло; пластикові планшети для імунологічних реакцій.

Опис методу. В силіконізовані пробірки або планшети поміщають 0,1 мл лейкосуспензії і додають 0,2 мл монодисперсних часток латексу в концентрації 5х103 /мл Оптимальне співвідношення кількості клітин і часток латексу складає 1:100. Суміш перемішують і поміщають в термостат на 30 хв. при температурі 37°С. Після інкубації тричі відмивають середовищем 199 і готують препарат.

Мазки готують, на ретельно вимитих знежирених предметних стеклах. Краплю лейкосуспензії поміщають недалеко від краю скла і шліфованим предметним склом, поставивши його під кутом 45° до поверхні попереду краплі і почекавши, поки крапля рівномірно розподілиться уздовж його ребра, легким швидким рухом проводять вперед, не відриваючи від предметного скла раніше, ніж вичерпається уся крапля. Правильно зроблений мазок має рівномірно матовий відтінок, не досягає країв скла і закінчується загостреними язичками. Приготовані мазки сушать на повітрі, потім фіксують 10 хв. в абсолютному метиловому спирті і фарбують по Романовському-Гімзе азур-еозином.

Склад готового барвника: азур II - 3 г, водорозчинний жовтий еозин - 0,8 г, метиловий спирт - 250 мл і гліцерин - 250 мл Для забарвлення мазків беруть 2 краплі основного розчину барвника на 1 мл дистильованої води.

Можна готувати фарбу безпосередньо перед фарбуванням мазків з азура II, еозину і дистильованої води в співвідношенні 3:2:5. На один мазок нашаровують 3 мл розчину барвника. Тривалість забарвлення 4550 хв. Після фарбування мазки переглядають під мікроскопом в імерсійній системі (вважають не менше 200 клітин) і роблять розрахунок показників фагоцитозу.

1.Фагоцитарний індекс (ФІ) - відсоток клітин, що вступили у фагоцитоз, від загального їх числа. У нормі складає 65 - 95 %.

2.Фагоцитарне число (ФЧ) - середнє число частинок латексу, що знаходяться внутрішньоклітинно (частка від ділення загального числа поглинених частинок лактексу на число клітин, що вступили у фагоцитоз). Характеризує поглинальну здатність нейтрофілів. У нормі складає 5 - 10.

Клінічне значення. Вивчення показників фагоцитозу має значення в діагностиці імунодефіцитних станів: часто рецидивуючі гнійні запальні процеси, рани, що тривало не загоюються, схильність до післяопераційних ускладнень. Показники фагоцитозу допомагають в діагностиці вторинних імунодефіцитних станів, викликаних лікарською терапією. У зв'язку з тим, що фагоцити беруть участь в елімінації імунних комплексів і активність фагоцитозу тісно пов'язана з активністю компонентів комплементу,

асаме С3, концентрацією IgG антитіл, наявністю інших опсонуючих чинників, дослідження фагоцитозу відіграє роль в діагностиці, оцінці активності і ефективності терапії при ревматизмі та інших хворобах сполученої системи. Найбільш інформативним для оцінки фагоцитарної активності слід рахувати фагоцитарне число, коефіцієнт фагоцитарного числа, які відбивають завершеність фагоцитозу.

Фагоцитарна активність нейтрофілів звичайно підвищується на початку розвитку запального процесу. Її зниження призводить до хронізації запального процесу та підтримання автоімунного процесу, тому що при цьому порушується функція руйнування та виведення циркулюючих імунних комплексів із організму.

Підвищення показників спостерігається при: антигенному подразненні внаслідок бактеріального запалення (продромальний період, період гострого прояву інфекції) при нормальній активності фагоцитозу; лейкоцитозі; алергічних реакціях; автоімунних захворюваннях; посиленні антитілозалежної цитотоксичності та реакції на донорський трансплантат.

Зниження показників спостерігається при: хронічних запальних захворюваннях бактеріальної та вірусної природи; вроджених дефектах фагоцитарної системи, синдромі Чедіака – Хігасі, хворобі Дауна, СЧВ, хворобі імунних комплексів, гранулематозі, дефіциті імуноглобулінів, комплементу; лікуванні цитостатиками, імунодепресантами, опроміненням іонізуючою радіацією; вторинних та первинних імунодефіцитах; новоутвореннях; тяжких опіках, травмах, стресах; кишкових та ниркових синдромах втрати білку; недостатності харчування; недостатності фагоцитозу; хронізації запального процесу.

НСТ-тест - тест відновлення нітросинього тетразолія. Спонтанний тест з НСТ (нітросинім тетразолієм) дозволяє оцінити стан кисневозалежного механізму бактерицидності фагоцитів (гранулоцитів) крові in vitro. Він характеризує стан і ступінь активації внутрішньоклітинної НАДФ-Н-оксидазної антибактеріальної системи.

Принцип методу ґрунтується на відновленні поглинутого фагоцитом розчинного барвника нітросинього тетразолію (НСТ) в нерозчинний діформазан під впливом супероксиданіону, що утворюється в НАДФ–Н– оксидазній реакції, яка ініціює процес стимуляції фагоциту. До фагоцитів додають жовтий фарбник нітросиній тетразолій, в нормі при його поглинанні метаболічна активність фагоцитів зростає, нітросиній тетразолій відновлюється, диформазан у вигляді грубодисперсних темносиніх гранул відкладається усередині або на поверхні клітин і продукти цієї реакції забарвлюють фагоцит у синій колір.

Матеріали і устаткування: 0,2 % розчин нітросинього тетразолію; 2 % водний розчин метилового зеленого; водяна баня; метанол; предметні стекла; силіконізовані пробірки.

Опис методу. Для постановки НСТ-тесту до 0,1 мл лейкосуспензії додають 0,1 мл 0,2 % нітросинього тетразолію. Суміш інкубують на во-

дяній бані при температурі 37°С впродовж 25 хв. і при кімнатній температурі впродовж 15 хв. Далі клітини тричі відмивають середовищем 199 і готують препарати. Висушені препарати фіксують метанолом і забарвлюють 2 % водним розчином метилового зеленого від 30 с до 5 хв.

Облік реакції включає підрахунок відносної і абсолютної кількості диформазан-позитивних лейкоцитів (можливо для спеціальних досліджень розрахунок робити окремо для нейтрофілів і моноцитів), обчислення середнього цитохімічного коефіцієнта реакції (СЦК). Для визначення СЦК при обліку реакції відмічають диформазан-негативні клітини - 0 міра активності; клітини з одиничними гранулами диформазану або з площею забарвленою диформазаном до 25-30 % - 1 міра активності; клітини, цитоплазма яких на 30-70 % зайнята глибками диформазану - 2 міра активності; клітини, у яких більше 70 % цитоплазми містить гранули диформазану - 3 міра активності. У кожному препараті підраховують 300 лейкоцитів. Середній цитохімічний коефіцієнт розраховують за формулою:

де 0, 1, 2, 3 - ступінь активності відновленого диформазану;

a, b, c, d - кількість клітин кожної ступені активності відповідно. Визначають рівень спонтанного (базального) та стимульованого ла-

тексом НСТ-теста: 0,1 мл гепаринізованої крові та 0,1 мл 0,1% водного розчину НСТ інкубують в конічних пробірках при температурі 37oС на протязі 40 хв. з 0,1 мл середи 199 – спонтанний НСТ-тест, або з 0,1 мл суспензії латексу – стимульований частками латексу НСТ-тест

Клінічне значення. Спонтанний НСТ-тест дозволяє оцінити ступінь антигенного подразнення не активованих in vitro гранулоцитів крові. Він характеризує ступінь активації внутрішньоклітинних антибактеріальних систем. Про порушення метаболізму фагоцитів судять по зниженню інтенсивності синього фарбування. При виявленні порушень визначають рівень цитохрому b558 та інших білків фагоцитів. Показники НСТ–тесту підвищуються в початковому періоді гострих бактеріальних інфекцій, тоді як при хронічному перебігу інфекційного процесу вони знижуються. Санація організму від збудників супроводжується нормалізацією показника. Різке зниження свідчить про декомпенсацію протиінфекційного захисту та є прогностично несприятливою ознакою. Показник спонтанного НСТ–тесту в нормі складає до 10 %.

НСТ-тест відіграє важливу роль в діагностиці хронічних гранулематозних захворювань, які характеризуються наявністю дефектів в НАДФ- Н-оксидазному комплексі. Для пацієнтів з хронічними гранульоматозними захворюваннями характерна наявність рецидивуючих інфекцій (пневмонія, лімфаденіт, абсцеси легенів, печінки, шкіри), що викликаються Staphylococcus aureus, Klebsiella spp., Candida albicans, Salmonella spp., Escherichia coli, Aspergillus spp., Pseudomonas cepacia, Mycobacterium spp . і Pneumocystis carinii.

Нейтрофіли у пацієнтів з хронічними гранульоматозними захворюваннями мають нормальну фагоцитарну функцію, але внаслідок дефекту в НАДФ-Н-оксидазному комплексі не здатні знищувати мікроорганізми. Спадкові дефекти НАДФ-Н-оксидазного комплексу у більшості випадків зчеплені з хромосомою X, рідше аутосомно-рецесивні.

Підвищення показників спостерігається при: антигенному подразненні внаслідок бактеріального запалення (продромальний період, період гострого прояву інфекції) при нормальній активності фагоцитозу; хронічному гранулематозі; лейкоцитозі; алергічних реакціях; автоімунних захворюваннях; посиленні антитілозалежної цитотоксичності.

Зниження показників спостерігається при: хронічних запальних захворюваннях бактеріальної та вірусної природи; хронізації гострого запального процесу, вроджених дефектах фагоцитарної системи, синдромі Чедіака-Хігасі, хворобі Дауна, СЧВ, колагенозах, хворобах імунних комплексів, дефіциті імуноглобулінів, комплементу; лікуванні цитостатиками, імунодепресантами, опроміненням іонізуючою радіацією; вторинних та первинних імунодефіцитах, злоякісних новоутвореннях, тяжких опіках, травмах, стресах; недостатності фагоцитозу.

Індукований НСТ–тест дозволяє оцінити функціональний резерв кисеньзалежного механізму бактерицидності фагоцитів. Тест використовують для виявлення резервних можливостей внутрішньоклітинних систем фагоцитів. При збереженій внутрішньоклітинній антибактеріальній активності у фагоцитах різко зростає кількість формазан-позитивних нейтрофілів після їх стимуляції латексом. Зниження показників стимульованого НСТ–тесту нейтрофілів нижче за 40 % та моноцитів нижче за 87 % свідчать про недостатність фагоцитозу. Величина стимульованого НСТ–тесту в нормі складає 20 -40 %.

Визначення імуноглобулінів IgA, IgM, IgG імуноферментним методом. Принцип методу оснований на виявлені в сироватці крові імуноглобулінів A, M, G за допомогою специфічних антиглобулінових