Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

вати еритроцити 0(I) груп крові резуснегативні. Приготування еритроцитів аналогічно описаному методу для еритроцитів барана. До суспензії лімфоцитів в тих же співвідношеннях додають одночасно еритроцити барана і еритроцити людини. Підраховують лімфоцити, що зв'язали еритроцити і барана, і людини. Реакцію з аутологічними еритроцитами проводять так само, як з алогенними.

Визначення В-клітин методом розеткоутворення з еритроцитами барана в системі ЕАС.

Тимуснезалежні В-лімфоцити мають на своїй мембрані специфічні детермінанти, що дозволяють диференціювати їх від тимус-залежних, тобто Т-лімфоцитів. Такими детермінантами є поверхневий (мембранний) IgМ, рецептори для Fc -фрагмента Ig G, третього компонента комплементу (С3) і вірусу Епштейна-Бара. Число лімфоцитів, що несуть IgA, G, Е або D, незначне (IgА - 1-5 %, IgD і IgЕ - 2-4 %). Застосовується метод виявлення В-клітин по їх здатності утворювати розетки з баранячими еритроцитами, навантаженими антитілами в середовищі комплементу. Такі еритроцити маркірують рецептори для Fc і С3 В-лімфоцитів.

Прилади і реактиви ті ж, що і для методу визначення Т-лімфоцитів. Аналогічно готують і суспензію лімфоцитів.

Хід виконання дослідження. Антисироватку, що містить антитіла до еритроцитів, готують шляхом імунізації кролика еритроцитами барана або бика. Кролику в крайову вену вуха вводять 3-5 мл 50% суспензії еритроцитів. На 4-6-й день у нього беруть кров і отримують сироватку, яка в цей період на висоті імунної відповіді переважно містить IgМ. Найкращий ефект отримують при роботі з гама-глобуліновою фракцією сироватки, яку отримують висолюванням в насиченому розчині аміаку або ріванолу. Антисироватку інактивують і визначають її гемолітичний і аглютинаційний титр. Можна використовувати готову кролячу гемолітичну сироватку.

Комплемент. Джерелом комплементу служать свіжі сироватки мишей. Безпородних мишей декапітують, кров зливають в пробірку, отримують сироватку, яку потім сорбують пулом людських еритроцитів і визначають активність комплементу в гемолітичній системі.

Сенсибілізація еритроцитів. Змішують рівні об'єми 1% суспензії баранячих еритроцитів (чи еритроцитів бика) і антисироватки до виду еритроцитів, що використовують в реакції (чи кролячої гемолітичної сироватки) в субаглютинуючому розведенні. Суміш інкубують 40 хв. при 37 °С, обережно струшуючи кожні 10 хв. Після термостатування еритро-

цити тричі відмивають фосфатним буфером до 10 хв. при 1500 об/хв. Супернатант відкидають, а до осаду додають первинний об'єм фосфатного буфера і рівний об'єм абсорбованої мишачої сироватки, що містить комплемент в розведенні 1:10. Суміш поміщають в термостат при 37°С на 30 хв. Знову еритроцити тричі відмивають. При відмиванні їх центрифугують обережно при 1000 об/хв. 5 хв., щоб не викликати аглютинації еритроцитів. Готують 0,5% суспензію еритроцитів і переглядають під мікроскопом. За наявності аглютинації еритроцитів суспензія непридатна. Готові еритроцити, навантажені антитілами і комплементом (ЕАС), можна зберігати в холодильнику (4°С) 4-5 днів.

Визначення ЕАС лімфоцитів. До 0,1 мл суспензії лімфоцитів додають 0,1 мл сенсибілізованих еритроцитів. Оптимальне співвідношення еритроцитів до лімфоцитів рівне 20:1. Суміш інкубують 45 хв. при 37 °С, після чого пробірки поміщають в лід. Підрахунок В-клітин проводять описаним вище способом.

Абсолютна кількість В–лімфоцитів в нормі складає 0,28 – 0,31х106 /л). Клінічне значення. Підвищення абсолютної кількості В-лімфоцитів спостерігається при: гострих бактеріальних, грибкових, паразитарних захворюваннях, СНІД (початковий період), хронічних захворювання печінки (цироз, вірусний гепатит), автоімунних захворюваннях (ревматоїдний артрит, СЧВ, ревматизм, колагенози), саркоїдозі, муковісцидозі, хворобі Крона, хворобі Вальденстрема, моноклональній гамапатії, інфекційному мононуклеозі, хронічному лімфолейкозі, в гострому періоді

повторної інфекції.

Зниження абсолютної кількості В-лімфоцитів спостерігається при: фізіологічній гіпогамаглобулінемії у дітей (у віці 3 – 5 міс), вродженій гіпогамаглобулінемії або агамаглобулінемії, новоутвореннях імунної системи, лікуванні цитостатиками і імунодепресантами, станах після видалення селезінки, недостатності гуморальної ланки імунітету.

Функціональні тести

Реакція бласттрансформації лімфоцитів (РБТЛ). Принцип методу. Під впливом неспецифічних і специфічних стимулів лімфоцити перетворюються на бласти - великі пиронінофільні клітини, здатні до проліферації і подальшого диференціювання, що приводить до збільшення в лімфоїдній тканині кількості реагуючих клітин. Це явище називають бласттрансформацією, яка постійно спостерігається в лімфоїдних тканинах в результаті антигенної стимуляції.

Відомі речовини, що чинять на лімфоцити мітогенну дію (табл. 12). Частіше для оцінки функціонального стану Т-лімфоцитів в клінічній лабораторній практиці використовують фітогемаглютинін (ФГА) - рослинний лектин, що отримується з насіння квасолі.

а ліпополісахарид (ЛПС) Е. coli - B-лімфоцитів в бласти в культурі клітин. Хід виконання дослідження. У стерильну пробірку наливають 0,5 мл роз-

чину гепарину, що містить 50 Од/мл. Кров беруть з вени у кількості 2 мл. Фітогемагіпотенін (ФГА) та ліпополісахарид (ЛПС) Е. coli використо-

вують в концентрації 0,1 мг/мл.

У 6 стерильних флаконів наливають по 2 мл середовища 199 та додають розчини пеніциліну і стрептоміцину з розрахунку 100 Од/мл кожного антибіотика. Флакони струшують і поміщають в холодильник. Готують 2 флакони для спонтанної РБТЛ (контроль). В 2 флакони додають по 0,05 мл розчину ФГА в концентрації 0,01 мг/мл культури (стимулююча доза 25 мкг/мл). Ще в 2 флакони додають 0,05 мл розчину ЛПС Е. coli в концентрації 0,01 мг/мл культури (стимулююча доза 25 мкг/мл). В усі флакони вносили по 0,2 мл крові. Флакони поміщають на 3 доби в термостат при 37оС. Щодня флакони струшували. Потім вміст кожного флакону переливають в центрифужні пробірки і центрифугують 5 хв. при 3000 об/хв. Осад ресуспензують повітрям і готують по 2 мазки на кожен флакон. Мазки фіксують, забарвлюють азуреозином по методу Романовського.

Мазки мікроскопують під імерсійним об'єктивом. Підрахунок відсотка бласттрансформації лімфоцитів роблять таким чином: на загальну кількість лімфоцитів (100 клітин) підраховують кількість середніх лімфоцитів і бластів. Результат РБТЛ визначають у відсотках бласттрансформації лімфоцитів (%).

Клінічне значення. Спонтанна проліферація лімфоцитів (бласттрансформація) буває підвищена у хворих, що перенесли багатократні переливання крові, хворих алергічними і автоімунними захворюваннями, при бактерійних і вірусних інфекціях, а також у новонароджених.

Зниження проліферативної відповіді на ФГА свідчить про наявність імунодефіциту. Низька відповідь в РБТЛ може корелювати з дефіцитом Т-клітин в периферичній крові або із зміною показника CD4/CD8 на користь клітин-супресорів. В деяких випадках (наприклад, в період відновлення після опромінення або інтенсивної хіміотерапії) низька відповідь на Т-клітинні мітогени може бути пов'язана з викидом в периферичну кров великої кількості незрілих Т-клітин. Низька відповідь в РБТЛ може бути також обумовлена порушенням продукції таких лімфокінів як ІЛ-1 і ІЛ-2.

Реакція гальмування міграції лейкоцитів в прямому капілярному тісті. Рухливість лейкоцитів периферичної крові, їх міграція до вогнищ тканинної деструкції, хемотаксис до ауто- і гетероантигенів, перерозподіл між лімфоїдними органами при стресово-адаптивних реакціях є складовою компонентою загальної системи реактивності, здібності до збереження постійності внутрішнього середовища.

Сенсибілізовані до певного антигену лімфоцити різко знижують швидкість рухливості в середовищі, в яке вносять антиген. Реакція гальмування міграції лейкоцитів (РГМЛ) здійснюється при безпосередній взаємодії антигену з антигенспецифічними рецепторами, а також через дію чинника, що пригнічує міграцію клітин, який виділяється при контакті із специфічним антигеном. Цей феномен дозволяє продемонструвати органоспецифічну клітино-опосередковану гіперчутливість.

Хід виконання дослідження. У 6 лунок планшета для імунологічних досліджень наливають по 0,2 мл досліджуваної гепарізованої крові (25 Од гепарину на 1 мл крові). Перші 2 лунки складають контроль. У інші 2 лунки вносять по 0,05 мл розчину ФГА в концентрації 0,01 мг/мл культури (дослід 1). У 2 лунки, що залишилася, вносять по 0,05 мл розчину антигену, наприклад лікарського препарату (дослід 2). Концентрацію антигену, що вноситься, розраховують експериментально і виражають в мг/мл Отриманими сумішами заповнюють капіляри з внутрішнім діаметром 0,7 мм і завдовжки 12 см на 1/3 довжини (до мітки, яку заздалегідь наносять на відстані 1/3 довжини від будь-якого краю). На кожен контроль і досвід використовують по 2 капіляри.

Заповнені капіляри запаюють воском або пластиліном і поміщають в маркіровані центрифужні пробірки. Капіляри в пробірці необхідно зафіксувати грудочкою вати або пластиліном в строго вертикальному положенні. Після цього капіляри центрифугують впродовж 5 хв. при 800 об/хв., а потім поміщають в термостат у вертикальному положенні і інкубують при температурі 37°С впродовж 24 год.

Облік результатів. Після інкубації роблять облік результатів. З цією метою під мікроскопом за допомогою окуляр-мікрометра визначають величину міграції основної маси лейкоцитів від межі еритроцитарного осаду в контролі і дослідах. Результати виражають у вигляді відсотка міграції у досвіді відносно контролю.

Унормі відсоток міграції складає 40-70%; підвищення до 90% або зниження до 30% є помірним; вище 90% і нижче 30% - значним.

Клінічне значення. Збільшення показника міграції свідчить про зниження функціональної активності лімфоцитів : їх здібності продукувати цитокіни. Виявлення сенсибілізованих до певного антигену лімфоцитів говорить про участь цього антигену в розвитку специфічної гіперчутливості і може бути використано в діагностиці пухлин, гломерулонефриту, диференціальній діагностиці міокардиту і кардіопатій.

РГМЛ використовують для оцінки гіперчутливості уповільненого типу (ГУТ), оскільки вона за своєю суттю є пробірним аналогом клітинних імунних реакцій ГУТ. У якості речовин, що модулюють (гальмують або активують) спонтанну міграційну активність лейкоцитів, застосовують ті ж мітогени, що і при РБТЛ. Крім того, можуть бути використані тканинні і мікробні антигени, стандартні алергени. Останні застосовують при діагностиці саркоїдозу, туберкульозу, альвеолітів і інших захворювань, що протікають з утворенням епітеліоїдно - клітинних гранулем (тканинні прояви ГУТ).

Тести навантажень з лікарськими та іншими речовинами. Зазвичай застосовують інкубацію клітин протягом певного часу з невеликими дозами, близькими до фізіологічних кількостей препаратів або без них. Тести ставлять з лікарськими препаратами, зокрема імунокоригуючими (тималін, левомізол і ін.) для того, щоб, визначивши дію препарату на клітини, прогнозувати ефективність його застосування при лікуванні.

Урозеткоутворенні найчастіше використовуються наступні тести навантаження:

1)інкубація клітин при 37оС протягом 0,5-2 год.;

2)інкубація клітин протягом того ж часу з розчинами різних препа-