Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

комплементу).

Для синдрому вторинних імунодефіцитів характерно: наявність тривалого торпідного перебігу інфекційного синдрому, тенденція до генералізації процесу; алопеції, дета гіперпігментації шкіри; СНІД; інші випадки набутої імунологічної недостатності.

Для лімфопроліферативного синдрому характерні: пухлини в імунній системі (лімфокейкози, лімфосаркоми, хвороба Ходжкіна, лімфоми, саркома Капоші); Х-залежний рецесивний лімфопроліферативний синдром у дітей: а) гіперплазія всіх груп лімфатичних вузлів із запальними процесами в них у сполученні з частими бактеріальними інфекціями іншої локалізації; б) спленомегалія; в) мононуклеоз в анамнезі.

Імунологічні тести

Методи, основані на вивченні поверхневих маркерів лімфоцитів.

Виділення лімфоцитів з периферичної крові методом градієнтного центрифугування.

Як правило, дослідження лімфоцитів в лабораторії включає етап виділення фракції мононуклеарних лейкоцитів (лімфоцитів) з периферичної крові. З цією метою використовують метод виділення клітин на градієнті щільності фікол-пак. Змішуючи фікол і пак в певній пропорції, отримують розчин, що має щільність 1.077 г/див. Кров нашаровують на розчин фіколу (градієнт). В результаті між плазмою і розчином фіколу утворюється ступінчастий градієнт щільності. Після центрифугування еритроцити і гранулоцити проходять крізь фікол і осідають на дно, а мононуклеари (лімфоцити і моноцити) залишаються у вигляді кільця в інтерфазі, т.ч. вдається розділити клітини, що мають щільність нижче (лімфоцити, моноцити) і вище (еритроцити. гранулоцити) ніж 1.077 г/см.

Матеріали і устаткування: 1. Фікол-400 - полісахарид. 2. Пак - рентгеноконтрастна речовина (аналоги: гіпак, ізопак, омніпак, верографін, урографін, уротраст та ін.). 3. Середовище 199. 4. Стерильна дистильована вода. 5. 3% розчин оцтової кислоти. 6. Центрифуга з бакет-ротором. 7. Ареометр з межами вимірів від 1.060 г/см до 1.090 г/см 8. Камера Горяєва. 9. Мікроскоп. 10. Лабораторний посуд, конічні центрифужні пробірки, ваги для урівноваження центрифужних пробірок та ін.

Опис методу

1.Приготування фіколу: 4,32 (8,64) г порошку фіколу-400 розчиняють

в48 (96) мл дистильованої води.

Після цього пробірки центрифугують з прискоренням 200-300 g при температурі 20°С, потім надосадкову рідину видаляють, а процедуру відмивання повторюють ще один раз. Замість середовища 199 можна використовувати будь-який буферний розчин рН 7,0-7,2 без іонів Са2+ (наявність іонів Са2+ сприяє конгломерації клітин, їх коагуляції). сироватки IV (АВ) групи крові людини. При використанні останньою потрібна інактивація при 56 °С впродовж 30 хв. і абсорбція еритроцитами. Для цього 0,5 мл осаду відмитих еритроцитів додають до 1 мл сироватки і інкубують впродовж 1 ч при 37 °С, періодично струшуючи. Бажана абсорбція сироватки пулом лейкоцитів, враховуючи можливість наявності антилейкоцитарних антитіл. При використанні людської сироватки необхідно враховувати вплив аутоцитолімфотоксинів, що проявляють максимум активності при 4 °С.

• Після відмивання готують робочу концентрацію лімфоцитів, що містить 2х106 клітин в 1 мл (20 клітин у великому квадраті камери Горяєва). Перед приготуванням робочої концентрації вираховують початкову кількість лімфоцитів:

до 0,1 мл осаду відмитих клітин додають 0,9 мл середовища 199, суспензію ретельно перемішують;

в чисту пробірку вносять 0,38 мл 3% розчину оцтової кислоти і 0,02 мл суспензії лімфоцитів;

в камері Горяєва підраховують лімфоцити в 100 великих квадратах і отримане число множать на 50000. Результат відповідає кількості лімфоцитів в 1 мл суспензії. Для приготування робочої концентрації лімфоцитів отримане число ділять на 2х106, з результату віднімають 1, залишок є кількістю поживного середовища 199 в мл, яке необхідно додати в пробірку з лімфоцитами.

Приготовлену за цією методикою суспензію лімфоцитів можна зберігати при температурі + 4°С впродовж 2 годин.

Нині для ідентифікації поверхневих структур лімфоцитів і ряду інших клітин в основному використовують 3 групи методів : 1) метод визначення субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів з використанням еритроцитарних діагностикумів; 2) метод лазерної проточної цитофлюориметрії; 3) метод визначення Т-лімфоцитів методом спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана (Е-РОК) і В-лімфоцитів методом розеткоутворення з еритроцитами барана в системі ЕАС.

Метод визначення субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів з використанням еритроцитарних діагностикумів "Анти-CD3", "Анти-CD4", "Анти-CD8", "Анти-CD22", "Анти-CD16"

Принцип методу оснований на визначенні субпопуляцій Т- і В-лім- фоцитів за допомогою реакції розеткоутворювання з еритроцитами, на яких адсорбовані моноклональні антитіла проти рецепторів CD3 (Т-лім- фоцити), CD4 (Т-хелпери), CD8 (Т-супресори), CD19 або CD22 (В-лім- фоцити), CD16 (натуральні кілери).

Облік результатів дослідження проводять у світловому мікроскопі з імерційною системою.

Перелік необхідного устаткування: Центрифуга. Пробірки (10 мл). Термостат. Холодильник. Автоматичні дозатори (20 – 200 мкл). Мікроскоп з імерційною системою. Предметне скло.

Додаткові реагенти: розчин градієнта густини d-1,077. Фізіологічний розчин або фосфатний буфер рН 7,2-7,4. 0,12% розчин глютарового альдегіду. Фарба Романовського-Гімза.

Одержання лейко суспензії. Кров беруть з вени в пробірку з гепарином. Для даних реакцій досить 3 мл крові. Мононуклеарну завись (лімфоцити) одержують на градієнті густини d – 1,077. Відмити клітини 2-3 рази фізіологічним розчином або фосфатним буфером рН 7,2-7,4. Бажана концентрація клітин у зависі 2х106/мл (20 клітин у великому квадраті камери Горяєва).

Підготовка діагностикума. Погойдуванням флакона осад еритроцитів ресуспендують без піноутворювання. Можливе ресуспендування стерильним шприцом ємністю 2 мл: голкою проколюють пробку, набирають суміш і випускають у флакон кілька разів (без піноутворювання). Набирають шприцом кількість, необхідну для роботи (на одну пробу 0,05мл) та переносять у стерильні пробірки.

Проведення дослідження

1.У пробірки вносять 0,05 мл (50 мкл) СD-діагностикума і додають 0,05 мл лімфозависі.

2.Інкубують суміш 40 хв. при 370С.

3.Центрифугують при 1000 об/хв. протягом 5 хвилин.

4.Залишають на 1 годину у холодильнику при +40С.

5.Відбирають надосадову рідину.

6.Додають до осаду 0,05 мл 0,12% розчину глютарового альдегіду й обережно ресуспензують (без утворювання піни!). Витримують 5-7 хвилин, знову обережно ресуспензують.

7.Роблять мазок приблизно на 1 см2 площі знежиреного предметного

скла.

8.Висушують, фіксують спиртом і зафарбовують фарбою по Романовському.

9.За допомогою світлового мікроскопу з імерційною системою підраховують відсоток розеткоутворюючих лімфоцитів, що зв’язують не менш 3-х еритроцитів із СD-діагностикумами на 200 клітин.

Не враховувати! Гранулоцити, агрегати клітин, а також лімфоцити, що потрапили в агрегати.

Можна підраховувати розеткоутворюючі лімфоцити в нативному препараті в камері Горяєва.

Оцінка результатів дослідження

1.Відсоток Т-лімфоцитів дорівнює відсотку розеткоутворюючих лімфоцитів із СD3-діагностикумом.

Норма дорослих 50-80% (середнє 60+5%); у дітей – 47-76% (середнє 55+4,8%).

Абсолютна кількість у 1 мкл крові = А х У х С : 10000, де: А – кількість лейкоцитів у 1 мкл крові, У – відсоток лімфоцитів у

формулі крові, С – відсоток розеткоутворюючих Т-лімфоцитів.

2.Відсоток Т-хелперів (Тх) дорівнює відсотку розеткоутворюючих лімфоцитів із СD4-діагностикумом.

Норма 33-46% (середнє 40+3,0%).

3.Відсоток Т-супресорів (Тс) дорівнює відсотку розеткоутворюючих лімфоцитів із СD8-діагностикумом.

Норма 17-30% (середнє 22+1%).

ІРІ – імунорегуляторний індекс. ІРІ: Тх/Тс = 1,4 – 2,0.

4.Відсоток В-лімфоцитів дорівнює відсотку розеткоутворюючих лімфоцитів із СD22-діагностикумом. Абсолютну кількість В-лімфоцитів визначають також як і Т-лімфоцитів.

Норма 17-31% (середнє 23+3,6%).

5.Відсоток натуральних кілерів дорівнює відсотку лімфоцитів, що утворюють розетки із СD16-діагностикумом.

Норма 12-23% (середнє 16+ 4,5%).

Слід зауважити, що мазки рекомендовано робити на добре обезжиреному спирт-ефіром склі в вигляді моношара. Запобігати утворення нашарування клітин. Діагностикуми повинні зберігатися при температурі від 2 до 10°С. Не допускається замороження!

Імуно-регуляторний індекс (показник CD4/CD8). Окрім визначення чисельності популяцій і субпопуляцій, важливе значення надається об-