Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

Таблиця 16

Шкала стандартних розведень лізованих еритроцитів по А. П. Коннікову

Для обчислення 50% одиниці гемолізу будують калібрувальну криву. Контролем служить оптична щільність пробірки № 4 зі шкали Коннікова, яка відповідає 50% гемолізу. На осі ординат відкладають величину оптичної щільності, виміряної при фотоколориметрії як контролю, так і досліджуваного матеріалу, і проводять горизонталь, паралельну осі абсцис, до перетину з перпендикулярами, встановленими на осі абсцис у крапках, відповідних 0,1 і 0,25 розведенням сироватки.

Приклад: пробірка зі шкали Коннікова № 4, що відображає 50% гемолізу, відповідає показаннями фотоелектроколориметра. Результати дослідження: фотоколориметрування першої пробірки, яка містить 0,1 мл сироватки, показує 0,07; другої пробірки, що містить 0,25 мл - 0,12. З'єднують ці дві точки і лінію з'єднання продовжують до перетину з лінією 50% гемолізу. З точки перетину опускають перпендикуляр на лінію абсцис, де відзначені свідчення розведення сироватки (наприклад 0,25).

Розрахунок ведуть за формулою: 0,25 мл (1:10) CH50 = 1 мл:х, де

Х = 1/0,25 = 100/25 = 4 CН50

У зв'язку з тим що 0,25 мл - це випробувана сироватка, розведена 1:10, результат треба помножити на 10, тобто. в 1 мл досліджуваної сироватки буде 40CH50. В сироватках здорових донорів зазвичай міститься 20-40 гемолітичних одиниць комплементу. Рівень комплементу у жінок нижчий, ніж у чоловіків, у межах 10%.

Клінічне значення. У клінічній практиці зустрічаються захворювання як зі зниженою активністю комплементу сироватки крові, так і випадки підвищення його активності (табл. 17).

Збільшення загальної кількості комплементу відбувається при: обструктивній жовтяниці, тиреоїдиті Хашимото, гострій ревматичній лихоманці, вузликовому поліартеріїті, дерматоміозиті, гострому інфаркті міокарду, виразковому коліті, тифозній лихоманці, цукровому діабеті І типу, синдромі Рейтера, подагрі.

Зменшення загальної кількості комплементу відбувається при: СЧВ з ураженням нирок, гострому гломерулонефриті, сироватковій хворобі, імунокомплексних захворюваннях, цирозі печінки, комбінованих імунодефіцитах, септичному ендокардиті з гломерулонефритом, рецидивуючих ангіоневротичних набряках, пароксизмальній холодовій гемоглобінурії, міастенії Гравіс, вірусному гепатиті з ураженням суглобів, змішаній кріоглобулінемії, лімфомі.

Крім загальної гемолітичної активності комплементу, за допомогою радіальної імунодифузії по Манчіні визначають концентрацію окремих компонентів комплементу (частіше С3 та С4 ). Визначення C3 і C4 дозволяє встановити переважаючий шлях активації комплементу. C4 витрачається лише при активації за класичним шляхом. C3 бере участь як у класичному, так і в альтернативному шляху активації, проте при активації за альтернативним шляхом рівень C3 знижується значніше.

Вивчення синтезу цитокінів на рівні окремих клітин

Імуноцитохімія. Ідея локалізації антигенів в тканинах за допомогою антитіл вперше була реалізована на початку 40-х років. Згодом імуноцитохімічні методи стали широко застосовуватися в молекулярній клінічній діагностиці, а з середини 70-х рр.., після відкриття моноклональних антитіл, їх роль ще більше зросла.

Імуноцитохімічні (ІЦХ) методи дозволяють локалізувати та ідентифікувати клітинні компоненти (в нашому випадку цитокіни), грунтуючись на їх зв'язуванні з антитілами. Місце зв'язування визначають за допомогою мічених антитіл або методом вторинного мічення.

Препарати для ІЦХ можуть бути трьох типів: а) відбитки;

б) мазки, отримані відповідними цитологічними або гематологічними методами;

в) препарати, отримані центрифугуванням клітинних суспензій. Останній метод кращий, коли в розпорядженні дослідника є біологічні рідини з невеликою кількістю клітин.

Роблять зрізи тканин і інкубують їх у розчині з антитілами до антигену інтересу (цитокіну). Антитіло часто пов'язано з флуоресцентним барвником, так що можна побачити локалізацію антигену. Коли антитіло знаходить антиген і формує з ним комплекс, вільні антитіла відмивають, і флуоресцентний барвник залишається в місцях локалізації антигену. Використовуючи спектрофотометр або флуоресцентний мікроскоп, можна з'ясувати локалізацію флуоресцентного барвника і, отже, визначити, де всередині клітини знаходиться антиген.

Причини широкого застосування ІЦХ очевидні: широкий вибір якісних реагентів, простота реалізації та навчання персоналу навичкам обліку результатів, а при світловій мікроскопії - можливість зіставлення з морфологією, зберігання і транспортування препаратів, відсутність необхідності в вузькоспеціальному обладнанні. Негативними моментами є суб'єктивність візуальної оцінки, труднощі організації контролю якості, неможливість врахування великої кількості клітин і, як наслідок, імовірність неадекватної оцінки малоклітинних популяцій.

ELISpot. Метод ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot) є високочутливою модифікацією методу ІФА, що дозволяє кількісно визначати клітини, що секретують певний цитокін. Висока чутливість методу ELISpot визначається тим, що продукт в момент аналізу знаходиться на поверхні

секретуючої клітини, будучи пов'язаним з її рецепторами. Крім того, стимуляція продукції цитокіну відбувається in vitro безпосередньо перед детекцією. В результаті метод ELISpot дозволяє виявляти 1 клітину, що секретувала цитокін з 100000, що в 20 - 200 разів точніше стандартного ІФА.

Схема методу ELISpot:

1.Цитокін-спеціфічні антитіла мобілізують на дні PVDF мікропланшет.

2.Блокують незв'язані сайти за допомогою протеїну.

3.Додаються клітини без активатора чи з ним. Протягом інкубації клітини активуються і починають виробляти і секретувати цитокіни, які специфічно зв'язуються з первинними антитілами.

4.Відмивають клітини.

5.Додають вторинні антитіла, які або кон'юговані з ферментом або біотінільовані з ним.

6.При використанні біотину додатково додається кон'югат.

7.Додається субстрат, в результаті з'являється забарвлена пляма в місці локалізації клітини, яка секретує цитокін.

8.В результаті підрахунку числа плям c допомогою ELISpot Reader AID в досліджуваних зразках і контролях (без активатора) визначають кількість клітин, що продукують певний цитокін.

Цитофлюориметрія. Це провідний метод у клінічній імунології. Він може бути використаний для оцінки внутрішньоклітинної продукції цитокінів різними клітинними популяціями.

Цитофлюориметрія дозволяє оцінити продукцію цитокіну на рівні однієї клітини за допомогою внутрішньоклітинного фарбування. Комбінація внутрішньоклітинного та поверхневого фарбування дає можливість максимально деталізувати інформацію про клітину-продуцента - приналежність до класу, підкласу,визначити її функціональну активність. Базальний рівень цитокінів у клітинах в стані спокою досить низький, тому попередньо проводять стимуляцію клітин in vitro в присутності індукторів продукції цитокінів та блокаторів внутрішньоклітинного транспорту (брефелдін А, моненсін). Потім фарбують поверхневі маркери, фіксують, пермеабілізують клітини і додають антитіла до внутрішньоклітинних маркерів. Далі клітини поміщають в контейнер для проб проточної цитометрії де вони під тиском впорскуються в центр швидкоплинного в тому ж напрямку потоку рідини через спеціально розроблений наконечник, в результаті чого швидкість руху клітин різко зростає і вони вибудовуються, утворюючи стовпчик, оточений оболонковою рідиною. Геометрія наконечника дозволяє створити умови ламі-

нарного потоку струменя зразка, в результаті чого не відбувається перемішування суспензії досліджуваних клітин з рідиною. Потрапляючи в подальшому в вимірювальну камеру приладу, клітини по черзі перетинаються променем лазера і збуджуються світлом певної довжини хвилі. У свою чергу, клітини посилають світлові сигнали іншої довжини хвилі, які, проходячи через систему оптичних лінз, фільтрів, двоколірних дзеркал, реєструються фотоелектронним помножувачем, що перетворює ці світлові сигнали в електричні, оброблювані комп'ютером. Два або три флуоресцентних сигналу, кожен з яких повідомляє про реакцію одного моноклонального антитіла зі специфічно розпізнаваним антигеном можуть бути зібрані з клітин разом з сигналами переднього (FSC-forward scatter) і бічного світлорозсіювання (SSC-side scatter). Сигнали світлорозсіювання, що характеризують розмір клітини (FSC), а також цитоплазматичні та мембранні особливості (SSC) прив'язують флуоресцентний аналіз до певних популяцій клітин. Отримані дані можуть бути записані, проаналізовані і представлені у вигляді гістограм. При цьому у разі одновимірної гістограми на осі абсцис відкладається інтенсивність флюоресценції клітин, а по осі ординат число клітин з певною інтенсивністю флюоресценції. Підсумувавши отримані дані по всій популяції клітин зразка, можна провести точний кількісний популяційний і субпопуляційний аналізи.

Визначення концентрацій цитокінів в біологічних рідинах імуноферментним методом. Для аналізу моноклональних антитіл використовують імуноферментний твердофазний аналіз - ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Assay). Це метод виявлення формування імунокомплексів - антитіла з антигеном.

Послідовність виконання методу:

1.Перші моноклональні антитіла (МКАТ) попередньо іммобілізують на внутрішніх поверхнях осередків твердого планшета для ІФА.

2.У перші два вертикальні ряди осередків планшета вносять по 100 мкл стандартів: А - 0 пг/мл досліджуваного цитокіну, В - 50 пг/мл, С - 250 пг/мл, D - 500 пг/мл, Е - 1000 пг/мл, F - 2000 пг/мл цитокіну. В інші осередки вносили по 100 мкл зразків. Зразки та стандарти вносять в рекомендованих буферах. Планшет інкубують протягом 1,5 год при 1820°С. Після інкубації розчин з осередків видаляють за допомогою піпетки. Потім осередки тричі промивають внесенням 300 мкл розчину для промивання. Залишки промивання видаляють за допомогою піпетки.