Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

SSP (sequence specific primer) - найбільш поширена і технічно проста методика, коли кожному алельному варіанту або групі алелей відповідає своя пара праймерів. Детекція результатів ампліфікації відбувається методом електрофорезу в гелі. Інтерпретація результатів HLA-типування зводиться до однозначного так/ні - присутність або відсутність продуктів ПЛР.

SSO (sequence specific oligonucleotide) - неспецифічна ампліфікація досліджуваної ділянки (локусу) ДНК з подальшою специфічною гібридизацією з міченими ДНК-зондами.

SBT (sequence-based typing) - метод, який застосовують для HLA - генотипування і визначення послідовності ДНК-мішені de novo (тобто для секвенування невідомої послідовності ДНК). Для здійснення SBTтехнології HLA-генотипування використовують набори реагентів ConsenSys SBT для зчитування послідовностей ампліфікованої ДНК, отриманих в результаті генотипування реагентами LABType SSO. В набори ConsenSys SBT входять праймери для секвенування і два буфера для промивки.

Всі методи HLA-генотипування припускають наявність 3х етапів: I етап - виділення ДНК, II етап ампліфікація і III етап - детекція результатів ампліфікації.

Для проведення аналізу береться кров з вени і з отриманого зразка виділяють лейкоцити (клітини крові, на поверхні яких найбільш широко представлені антигени тканинної сумісності). HLA-фенотип визначається методом полімеразної ланцюгової реакції. ПЛР є високоточним методом, його достовірність сягає 98%.

Реакція ампліфікації ДНК in vitro заснована на здатності молекул нуклеотидтрифосфатів в присутності ДНК-полімерази при відповідних умовах (рН, іонна сила розчину, температура) утворювати на матриці (одноланцюговою ДНК) комплементарний ланцюг. Необхідною умовою синтезу є наявність праймера - олігонуклеотиду, який синтезується штучно.

Для підвищення точності реакції і збільшення чутливості, як правило, використовують пару праймерів. Управління ходом реакції йде за допомогою зміни температурних умов. При певній температурі (залежить від нуклеотидного складу ДНК) йде розбіжність подвійного ланцюга ДНК - плавлення. Зниження температури призводить до зворотнього процесу - з'єднанню комплементарних ланцюгів - отжигу. При надлишку праймерів в розчині ймовірність відпалу на ДНК-матриці праймера набагато вища, ніж приєднання повного ланцюга. І, оскільки праймер менше матриці,

починається активне добудовування (синтез) комплементарного ланцюга. Швидкість добудови досягає декількох сотень (іноді більше тисячі) нуклеотидів в секунду. Таким чином, наприкінці циклу є подвоєний набір ДНК (точніше не всієї ДНК, а ділянки, обмеженого праймерами). Знову підвищується температура - плавлення - відпал - синтез - і в розчині вже 4 копії вихідної матриці. Кількість копій (ампліфікатов) зростає в геометричній прогресії, і після 30-40 циклів у розчині знаходиться від 10 млн. до 10 млрд. копій вихідної матриці. Причому, оскільки є пара праймерів, ампліфікати будуть строго певного розміру. Така кількість ДНК можна візуально виявити, наприклад, при електрофорезі на агарозному гелі з бромідом етидію.

Технологія SSР (Sequence Specific Primers) базується на ПЛР з використанням алель-специфічних праймерів, "уловлюючих" шукані HLA ділянки ДНК з подальшою детекцією методом гель-електрофорезу.

Етапи технології:

1.Виділення ДНК з досліджуваного зразка крові, кісткового мозку або тканини (від 15 хв. до 2 год., в залежності від методу).

2.ДНК ампліфікація (45 хв. - 1,5 год.). ДНК розкапується в лунки ПЛР планшету, кожна з яких містить праймери певної специфічності. Кількість лунок (ПЛР реакцій) відповідно визначається кількістю типованих локусів і кількістю алельних варіантів в кожному локусі. Так, наприклад, для типування локусу DR з низьким дозволом (скринінгового HLA-типування) зазвичай визначають близько 24 специфічностей (24 лунки ПЛР планшета).

3.Електрофорез (20-30 хв.). Амплікон переносяться в лунки агарозного гелю. У тих лунках, де специфічності праймерів збіглися зі специфічними ділянками ДНК, з'являється смуга продукту в гелі.

4.Аналіз результатів. По таблиці інтерпретації або за допомогою програми визначають, якій HLA-алелі відповідає смуга продукту.

Переваги SSP технології: здійснює типування як на низькому, так і на високому рівнях; визначає точковий алельний поліморфізм, практично порівнянний з секвенуванням.

Основний недолік - низька продуктивність. У 96-лунковий термоциклер при низькорівневому типуванні можна помістити лише один зразок (DRлокус - 24 пробірки, А-локус - 24 пробірки, В-локус - 48 пробірок). Час, витрачений таким чином на типування одного зразка, наприклад, по А, В, DR від виділення ДНК до інтерпретації результатів складе приблизно 3 год. За день можна протипувати 2-3 людини.

SSP технологію можна рекомендувати для HLA-лабораторій, що використовують як низько-, так і високорівневе типування, і з середнім навантаженням до 5-7 чоловік на тиждень: трансплантологічних відділень, клінік пересадки кісткового мозку, клінік та інститутів, що виявляють генетичні захворювання.

Технологія SSO (sequence specific oligonucleotide) включає етапи ПЛР з наступною детекцією шляхом гібридизації ампліконів з олігонуклеотидними зондами.

Етапи технології:

1.Виділення геномної ДНК аналогічно SSP технології.

2.Ампліфікація зразка відбувається в одній ПЛР пробірці, тобто не утворюються «специфічні» HLA амплікони, а утворюється загальна геномна ДНК зразка (45 хв. - 1,5 год.).

3.Блот-гібридизація являє собою процес зв'язування (кон'югації) тепер уже специфічних ділянок ДНК з олігонуклеотидними зондами, пришитими на спеціальні нейлонові смужки - стрипи. Незв'язані ділянки ДНК відмиваються, а кон'югований фрагменти, відповідні HLA аллелям, фарбуються пероксидазою (1,5 - 2:00).

4.Інтерпретація результатів за допомогою спеціального обладнання. Переваги SSO технології: здатність до повної автоматизації; чутли-

вість системи дозволяє виявити точкові мутації генів HLA; спеціальна технологія зондів (можливе визначення поліморфізму двох або більше зчеплених генів на одному ланцюгу ДНК; зниження числа повторних типувань за рахунок відсутності неоднозначних результатів, які утворюються при звичайному типуванні); постгібридизаційна стабільність (одночасна обробка результатів кількох проб); ампліфікація для типування кожного локусу в одній пробірці (визначення локусів A, B, C, DRB1, DRB3, 4, 5, або DQB1 в одній пробірці); висока продуктивність; мінімізація похибок генотипування за рахунок одного процесу ампліфікації; час детекції кожного зразка менше 1 хвилини; на відміну від методу SSP час дослідження займає приблизно 2 год.

Основний недолік SSO технології з її допомогою не можна проводити HLA - типування на високому рівні. Максимальна роздільна здатність від низького до середнього рівня. Тому при необхідності проводити типування на високому рівні лабораторія повинна мати додаткову систему для електрофорезу.

SSO технологія рекомендується: кріо-сховищ пуповинної крові; регістрів донорів кісткового мозку; великим трансплантологічним центрам; онкологічним центрам.

HLA-генотипування методом секвенування. Технологія SBT секвенування є останнім етапом молекулярного аналізу попередньо-виділе- ного, ампліфікованого і протестованого простішими методами фрагмента ДНК. Секвенування являє собою визначення нуклеотидної послідовності фрагмента ДНК шляхом отримання серії комплементарних молекул ДНК, що розрізняють за довжиною на одну підставу.

Для здійснення SBT технології HLA-типування лабораторія повинна мати у своєму розпорядженні додатково секвенатор.

Етапи технології:

1.Гібридизація досліджуваного фрагменту ДНК з праймером.

2.Ферментативний синтез ДНК.

3.Денатурація отриманих продуктів формамід (в результаті утворюються унікальні олігонуклеотидні послідовності, які розрізняються по довжині і містять праймер).

4.Електрофорез в поліакриламідному гелі на чотирьох доріжках (за числом типів нуклеотидів).

6.Аналіз результатів на радіоавтографі.

Переваги SBT технології: «золотий стандарт» HLA типування; повна інформація про сиквенси; секвенування високого рівня (до 4-го знака); можливість детекції нових алелів; можливість адаптації до великих лабораторних потоків.

Реагенти Abbott Molecular дозволяють використовувати стратегію гетерозиготного секвенування: типування алелей HLA-антигенів з високим дозволом, включаючи ПЦР-ампліфікацію і секвенування з флуоресцентною ДНК;

Особливості: 1 локус-специфічна ПЛР; типовані локуси: HLA-A,-B,-C, -DRB1,-DQB1,-DPB1; включений набір праймерів для «грубого» секвенування; програмне забезпечення здійснює аналіз і підказує подальші кроки для уточнюючого секвенування; для дозволу невизначеностей використовуються HARPs (Hemizygous Ambiguity Resolution Primer).

Клінічне значення HLA-типування та генотипування

Послідовність етапів генотипування із застосуванням різних технологій при підборі донора для трансплантації повинна виглядати таким чином:

1) генотипування великої кількості зразків за технологією rSSO зі середньовисоким рівнем для звуження кола можливих донорів;

2)генотипування за технологією SSP для розрішення неоднозачностей, отриманих при генотипуванні методом SSO;

3)генотипування з високим розрішенням реципієнта і донора з застосуванням наборів LABType SSO HD і LABType SSO HLA Exon 4-7 Supplement для отримання алельного рівня (аналогічний рівень досягається при секвенування);

4)визначення рівня серопозитивності донорів та реципієнта; Моніторинг рівня посттрансплантаційних антитіл і профілю специ-

фічності антитіл до антигенів HLA.

Необхідно застосовувати всі технології HLA-типування. Технології SSO і SSP не конкурують, а доповнюють один одного.

Показання до призначення аналізу:

•Типування генів HLA II класу застосовується для діагностики деяких форм безпліддя і невиношування вагітності, які можуть бути наслідком високої гомології генів HLA II класу в подружній парі при повній фертильності партнерів.

•Типування генів HLA II класу є обов'язковим дослідженням для підбору донора при трансплантації органів.

•Деякі алельні варіанти генів HLA II класу асоційовані з підвищеним ризиком захворювань: цукровий діабет I типу, ревматоїдні захворювання, аутоімунний тиреоїдит, сприйнятливість до інфекційних захворювань та ін.

Показання для HLA-типування та генотипування при вагітності.

Кожен з генів може мати тисячі варіантів - алелів. Різноманітні поєднання алелей і забезпечують багатоваріантність комбінацій генів. Саме збіг алелей і говорить про генетичну сумісність чи несумісність двох людей. Дитина отримує по одному гену від матері й від батька.

Невідповідність подружжя за HLA-антигенами і відмінність зародка від материнського організму є важливим моментом, необхідним для збереження і виношування вагітності. Якщо є сумісність подружжя за HLAантигенами II класу, то антитіла до них не виробляються і не захищають плід від материнських природних кілерів. Наявність більш ніж 3 загальних генів HLA у чоловіка і дружини є однією з причин звичних викиднів.

Подібність подружжя за антигенами тканинної сумісності призводить до "схожості" зародка на організм матері, що стає причиною недостатньої антигенної стимуляції імунної системи жінки, і необхідні для зачаття або збереження вагітності реакції не запускаються. Велике число співпадаючих антигенів головного комплексу гісто-сумісності (HLA) у подружжя