Материал: Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

7.2. У позитивному контрольному зразку (К+) для наборів з внутрішнім контролем повинні виявлятися дві смуги: 1) смуга оранжево-чер- воного кольору, відповідна позитивного контролю (ПК) (табл. 20); 2) смуга оранжево-червоного кольору, що відповідає внутрішньому контролю. Для наборів без внутрішнього контролю повинна виявлятися одна смуга, відповідна ПК.

7.3.Аналізовані проби:

-відсутність смуги оранжево-червоного кольору строго на рівні позитивного контролю (ПК) свідчить про відсутність ДНК шуканого збудника в аналізованій пробі;

-наявність смуги, відповідної за електрофоретичну рухливість позитивного контролю - про присутність ДНК пошукового збудника в аналізованій пробі.

У всіх негативних зразках повинна виявлятися смуга оранжевочервоного кольору, що відповідає внутрішньому контролю ВК.

Якщо в аналізованому зразку для наборів з внутрішнім контролем відсутня як смуга позитивного контролю, так і смуга внутрішнього контролю, це означає, що реакція ампліфікації не пройшла (можливі причини: проба містить речовини, що інгібують ПЛР, неадекватна робота ампліфікатора, помилка виконання протоколу проведення аналізу).

Вцьому випадку, якщо в пробі присутня велика кількість ДНК шуканого збудника, то на гель-електрофореграмі може не спостерігатися смуги внутрішнього контролю (зразок 3 з таблиці 21). Це цілком допустима ситуація і такі проби слід інтерпретувати як позитивні.

8.Інтерпретація результатів

9. Дії в разі інгібування реакції ПЛР

9.1.При відсутності в аналізованих зразках як смуги ВК, так і смуги ПК (інгібування реакції) необхідно провести повторний аналіз проби, починаючи зі стадії виділення ДНК.

9.2.100 мкл розчину виділеної згідно п.4. ДНК перенести в нову пробірку з реагентом «ДНК-ЕКСПРЕС» і провести всю процедуру виділення (п.п. 4.1. - 4.4), постановки ПЛР (п.п. 5.1. - 5.10) та аналізу результатів (п.п. 6.1. - 6.8) заново.

9.3.Якщо процедура повторної обробки і аналізу проби, не призводить до появи смуги ВК або ПК, рекомендується повторне взяття біоматеріалу у пацієнта.

10. Умови зберігання і транспортування реагентів

10.1.Комплект «Набір для виділення ДНК/РНК із сироватки або плазми крові» повинен зберігатися при +2 ... +8оС протягом усього терміну придатності (6 місяців з дати виробництва). Допускається зберігання і транспортування цього комплекту при кімнатній температурі не більше 2 діб.

10.2.Комплекти для проведення ампліфікації (окремі компоненти) повинні зберігатися при температурі мінус 18-25оС протягом усього терміну придатності (6 місяців з дати виробництва). Допускається зберігання і транспортування цього комплекту при температурі не вище 0оС не більше 2,5 діб.

10.3.Комплекти для проведення ампліфікації формату One Step повинні зберігатися при температурі від +2 ... +8оС. Термін зберігання

-3 місяці з дати виробництва.

10.4.Комплект для електрофоретичної детекції № 1, агарози, 50хТАЕбуфер і розчин бромистого етидію може зберігатися при кімнатній температурі протягом усього терміну придатності (вказаний на етикетці).

10.5.Комплект для електрофоретичної детекції № 2 і готові в агарозному гелі зразки повинні зберігатися при +2 ... +8оС протягом усього терміну придатності (6 місяців з дати виробництва).

Імунологічні (серологічні) методи дослідження інфекційних хвороб

Серологічні реакції застосовують в двох напрямах:

-Виявлення з діагностичною метою антитіл в сироватці крові обстежуваного за наявністю набору відомих антигенів. Як антигени застосовують суспензії мікроорганізмів, інактивовані хімічними або фізичними методами, або використовують діагностикуми, що представляють фракції мікроорганізму. Як правило, результати серологічної діагностики отримують при дослідженні парних сироваток крові хворих, узятих в перші дні хвороби і через певні проміжки часу від початку захворювання.

-Визначення родової, видової і типової приналежності мікроорганізму або його антигенів з відомими імунними сироватками. Імунні сироватки повинні містити антитіла у високому титрі і бути строго специфічними. У лабораторній практиці застосовують серологічні реакції, засновані на прямій взаємодії антигену з антитілом (аглютинація, преципітація) і опосередковані реакції (реакція непрямої гемаглютинації, реакція скріплення комплементу), а також реакції з використанням мічених антитіл або антигенів (імуноферментний, радіоімунний аналіз, метод флюоресцуючих антитіл).

Реакція аглютинації застосовується в лабораторній практиці для ідентифікації виділених мікроорганізмів або для виявлення специфічних антитіл в сироватці крові. Механізм реакції заснований на взаємодії детермінантних груп антигену з активними центрами імуноглобуліну

велектролітному середовищі.

Реакція преципітації. Феномен преципітації полягає у взаємодії дрібнодисперсних антигенів (преципітиногенів) з відповідними антитілами (преципітинами) і утворенням преципітату. Постановку реакції преципітації здійснюють двома методами: у рідкому середовищі - за типом реакції флокуляції, кільцепреципітації або в щільному середовищі

в агарі (гелі). Реакцію преципітації застосовують в двох цілях: виявлення антигенів по відомій імунній сироватці, або антитіл з використанням відомих антигенів. Існує багато варіантів постановок реакції, але найчастіше використовують наступні методики: реакція преципітації в гелі по Оухтерлоні, радіальна імунодифузія по Манчині, реакція імуноелектрофорезу, реакція флокуляції, кільцепреципітації.

Реакція скріплення комплементу (РСК) використовується для лабораторної діагностики венеричних захворювань, рикетсіозів, вірусних інфекцій (грип, кір, кліщовий енцефаліт та ін.) і ґрунтується на здатності комплементу зв'язуватися з комплексом антиген+антитіло. Комплемент адсорбується на Fc-фрагменті імуноглобулінів G і М. Реакція протікає в дві фази. Перша фаза - взаємодія антигену і антитіла. Як матеріал, що містить антитіла, використовується досліджувана сироватка, до якої додається відомий антиген. До цієї системи додають стандартний комплемент і інкубують при 37 °С протягом однієї години.

Друга фаза - виявлення результатів реакції за допомогою індикаторної гемолітичної системи (еритроцити барана і гемолітична сироватка кролика, що містить гемолізини до еритроцитів барана). До суміші антиген + антитіло + комплемент (1-а фаза) додають індикаторну систему і знов інкубують при 37°С протягом 30 - 60 хв., після чого оцінюють результати реакції. Руйнування еритроцитів відбувається у разі приєднання до гемолітичної системи комплементу.

Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА). РНГА застосовують в двох варіантах: з відомим антигеном для виявлення антитіл або з відомими антитілами для виявлення антигену. Ця реакція специфічна і застосовують її для діагностики захворювань, що викликані бактеріями і рикетсіями. Для постановки РНГА використовують еритроцитарні діагнос- тикуми, приготовані шляхом адсорбції на еритроцитах антигенів або антитіл залежно від мети дослідження. У позитивних випадках ступінь аглютинації еритроцитів відзначають плюсами.

Реакція гемаглютинації (РГА) і реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). В основі РГА лежить здатність еритроцитів склеюватися при адсорбції на них певних антигенів. Як досліджуваний матеріал при гемаглютинації використовують алантоїсну, амніотичну рідину, суспензію хоріоналантоїсних оболонок курячих ембріонів, суспензії і екстракти з культур або органів тварин, заражених вірусами, нативний інфекційний матеріал. РГА не є серологічною, оскільки відбувається без участі імунної сироватки і використовується для вибору робочого розведення антигену для постановки РГГА або наявність антигену (вірусу) в

досліджуваному матеріалі (наприклад, при грипі). У реакції використовуються еритроцити тварин, птахів, людини I (0) групи крові. При позитивному результаті РГА дослідження продовжують, визначаючи тип виділеного вірусу за допомогою реакції гальмування гемаглютинації типоспецифічними сироватками.

РТГА заснована на властивості антисироватки пригнічувати вірусну гемаглютинацію, оскільки нейтралізований специфічними антитілами вірус втрачає здатність аглютинувати еритроцити.

Реакція імунофлуоресценції (РІФ). РІФ заснована на з'єднанні антигенів бактерій, рикетсій і вірусів із специфічними антитілами, міченими флюоресцуючими фарбниками (флуоресцеїнізотіоцианат, родамін, В- ізотіцианіт, лісатинродамін В-200, сульфохлорид та ін.), що мають реак- ційно-здатні групи (сульфохлорид, ізотіоцианит та ін.). Ці групи з'єднуються з вільними аміногрупами молекул антитіл, які не втрачають при обробці флуорохромом специфічної спорідненості до відповідного антигену. Комплекси антиген-антитіло, що утворилися, стають добре видимими структурами, що яскраво світяться, під люмінесцентним мікроскопом. З допомогою РІФ можна виявляти невеликі кількості бактерійних і вірусних антигенів.

Імуноферментний аналіз (ІФА) використовується для виявлення антигенів за допомогою відповідних ним антитіл, кон’югованих з ферментом-міткою. Після з'єднання антигену з міченою ферментом імунною сироваткою в суміш додають субстрат і хромоген. Субстрат розщеплюється ферментом, а його продукти деградації викликають хімічну модифікацію хромогену. При цьому хромоген міняє свій колір - інтенсивність забарвлення прямо пропорційна кількості молекул антигену і антитіл, що зв'язалися. ІФА застосовують для діагностики захворювань, викликаних вірусними і бактерійними збудниками.

Діагностика in vitro (визначення IgE антитіл) специфічної алергії

Проведення ефективних лікувально-профілактичних заходів у пацієнтів з алергійними захворюваннями повинне здійснюватися з урахуванням достовірної інформації про те, на які конкретно алергени має місце сенсибілізація у хворого. Міжнародними консенсусами визначено, що діагностика алергії повинна базуватися на визначенні специфічних IgE антитіл. У зв'язку із цим, особливу актуальність здобуває достовірна специфічна діагностика алергії, з визначенням причинних алергенів у