Автореферат: Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий), определяемое методом замедленной люминесценции

Рис. 18. Распределение семян по влажности (а) и фосфоресценции порфиринов (б) в партии семян с 72%-ной всхожестью после 20 ч набухания. 1 - семена фракции I, из которых выросли нормальные проростки; 2 - семена фракции II, из которых выросли ненормальные пророст-ки; 3 - ненаклюнувшиеся семена.

Семена с высоким уровнем свечения - 40 и более отн. ед. (концен-трация кислорода менее 10 мкМ) не проклевывались. Поскольку зародышевой корешок не мог проткнуть семенную оболочку, то они задохнулись во время набухания (кривая 3).

У мертвых семян фосфоресценция порфиринов не возникала, т.к. они не дышали (рис. 17, прямая III). Поэтому можно было отличить задохнувшиеся семена от исходно мертвых.

Если у семян с высоким уровнем фосфоресценции порфиринов (значительный дефицит кислорода) удаляли оболочку, то некоторые из них прорастали, но проростки имели морфологические нарушения, т. е. были ненормальными.

Оставалось неясным, почему даже после восстановления нормальной обеспеченности зародышей кислородом из семян фракции II вырастали проростки с морфологическими дефектами.

III.2.7. Синтез общих белков и ДНК на ранних стадиях набухания семян гороха. Для прорастания семян и нормального роста необходимы синтез белков и ДНК. Нарушение синтеза ДНК препятствует делению клеток зародышевых осей. Торможение синтеза белка нарушает процесс растяжения клеток [Гумилевская и др., 1996; Obroucheva, 1999]. Вероятно, нарушение этих процессов могло быть причиной появления проростков с морфологическими дефектами из семян фракции II. Как мы показали ранее, судя по включению меченого [35S]метионина в белки осевых органов в течение первых 3-х часов набухания семян гороха, незначительные различия в скорости этого процесса у семян первой и второй фракций определяются только разной скоростью набухания [Veselova et al., 2004].

Также был изучен процесс репликации ДНК на стадии подготовки клеток зародышевых осей к делению. После созревания семян большинство ядер в меристематических клетках содержат 2С набор ДНК (фазы G1 или G0 клеточного цикла) [Обручева, 1982; Bino et al., 1993; Redfearn et al., 1995; Gornik et al., 1997]. В сухих семенах гороха I II и III фракций около 90% ядер содержали 2С набор ДНК (табл. 1). С увеличением времени набухания увеличивалась число ядер в фазе G2, содержащих 4С набор ДНК. Динамику этого процесса отражает отношение 4С/2С.

У мертвых семян фракции III удвоение ДНК не происходило и количество ядер с 2С набором ДНК не изменялось. В случае семян гороха фракций I и II в течение 48 часов набухания количество ядер с 2С набором ДНК уменьшалось и увеличивалось число ядер с 4С набором ДНК. Причем у семян фракции II, которые набухали быстрее и имели большую влажность, отношение росло сильнее. Рост отношения 4С/2С означал, что повреждения ДНК либо были незначительны, либо репарированы на ранних стадиях гидратации. Известно, что процесс удвоения ДНК может начинаться только после ликвидации ее нарушений [Osbornе, 1983; Smith, Berjak, 1995].

Таблица 1. Соотношение ядер в состояниях 2С и 4С у зародышевых осей семян гороха разных фракций во время набухания (%).

Однако после проклевывания на 48 ч набухания увеличение отношения 4С/2С у семян фракции II прекращалось, в то время как у семян фракции I оно продолжало расти. Задержка репликации ДНК происходила накануне или во время проклевывания. Она могла быть вызвана продуктами брожения, образующимися под семенной оболочкой [Al-Ani et al., 1985]. Дефицит кислорода под семенной оболочкой у семян фракции II возникал после 12-14 ч набухания и продолжался до момента проклевывания (40-46 ч набухания). Тем не менее, в это время удвоение ДНК происходило, т.е. не гипоксия в данном случае являлась причиной прекращения репликации ДНК.

III.2.8. Постгипоксический окислительный стресс. Мы обратили внимание на то, что торможение удвоения ДНК у семян второй фракции происходило после их проклевывания, т.е. после перехода от гипоксии к аэробным условиям. Поэтому было предположено, что причиной повреждения зародышевых осей может быть постгипоксический окислительный стресс. Этому явлению в последние годы уделяют большое внимание в биологии и медицине. Интенсивно обсуждают цитоксическое действие активных форм кислорода в пост-гипоксический период, их роль в повреждении ДНК, белков и липидов [Crawford et al., 1994; Pfister-Sieber, Brandle, 1994; Puntarulo, 1994; Khan, Wilson, 1995; Wojtaszek, 1997; Inze et al., 1998; Bailly et al., 1998].

Рис. 19. Кинетика фосфоресценции порфиринов и хемилюминесценции зародышевых осей в период естественной аэрации сразу после 14-часовой гипоксии.

В параллельных экспериментах мы показали, что во время поступления воздуха к зародышевым осям семян гороха после 12-14-часовой гипоксии тушится фосфоресценция порфиринов (появляется кислород воздуха) и одновременно увеличивается спонтанная хемилюминесценция (рис. 19). Интенсивность спонтанной хемилюминесценции растений отражает количество активных форм кислорода, генерируемых клетками корней молодых проростков [Vartapetian et al., 1974; Тарусов, Веселовский, 1978;]. Поэтому рост хемилюминесценции при контакте зародышевых осей с воздухом после гипоксии свидетельствует о резком возрастании в них генерации актвных форм кислорода.

Таблица 2. Хемилюминесценция эмбриональных осей семян гороха (фракция I без гипоксии и фракция II после 14-часовой гипоксии) и влияние ингибиторов активных форм кислорода.

МЭА-меркаптоэтиламин [10-3М], ПГ - пропил галлат [10-4М],

КАТ - каталаза [200U/мл каталазы]

Допуск воздуха к зародышевым осям после гипоксии увеличивал уровень хемилюминесценции почти на два порядка (Табл. 2). Хемилюминесценцию тушили каталаза и антиоксиданты пропилгаллат и ?-меркаптоэтиламин. По-видимому, основной формой активного кислорода на поверхности клеток является перекись водорода. Стационарная концентрация Н2О2 на поверхности семян без гипоксии около 1 мкМ то в постгипоксический период стационарная концентрация перекиси может достигать ~80 мкмолей. В таких количествах Н2О2 полностью тормозит деление как растительных, так и животных клеток, нарушая ДНК [Crawford et al., 1994].

Чтобы выяснить, происходит ли повреждение ДНК в пост-гипоксический период, исследовали состояние ДНК в клетках зародышевых осей. На рисунке 20 показаны электрофореграммы ДНК из семян гороха фракций I и II. Профиль ДНК, выделенной из зародышевых осей семян фракции I выглядит компактным (гель 1). Гели 2 и 4 - ДНК, выделеной из зародышевых осей семян гороха второй фракции после 14 часовой гипоксии. Но гель 4 -после 15 минутной аэрации зародышевых осей, а гель 2 - после 6 ч экспонирования осей на воздухе (деградация ДНК). Т. е. деградация ДНК происходит не во время гипоксии, а развивается в пост-гипоксический период. Если семена в этот период инкубировали в присутствии пропилгаллата, то деградация ДНК была значительно меньше (гель 3).

Эти данные указывают на то, что именно активные формы кислорода в постгипоксический период являются причиной прекращения удвоения ДНК и последующей ее деградации. И значит, причиной образования ненормальных проростков из семян фракции II, и снижения всхожести всей партии семян, является постгипоксический окислительный стресс во время прорастания.

Рис. 20. Электрофореграмма ДНК, изолированной из зародышевых осей набухших семян гороха. Пояснения в тексте.

У семян фракции II, в отличие от семян фракции I, дефицит кислорода возникает из-за их более быстрого набухания и активации дыхания.

III.2.9. Почему возрастает скорость поглощения воды семенами после перехода из фракции I во фракцию II. Методом ФКТ были отобраны семена разного качества: необлученные семена фракции I (уровень ФКТ 405 отн.ед.), семена фракции II из партии, облученной в дозе 3 Гр (605 отн.ед.), и «улучшенные» семена фракции I (40 5 отн.ед.), облученные в дозе 10 Гр. Набухание семян фракции II слабо зависело от температуры (Q10 = 1,2; энергия активации 3 ккал/моль). Для семян фракций I и «улучшенных» - Q10 = 2 (Еа = 12 ккал/моль). Следовательно, при набухании семян фракции II вода в клетки поступает, по-видимому, через водные каналы, тогда как при набухании семян фракций I и «улучшенных» она диффундирует преимущественно через липидный бислой.

С целью проверить это предположение был проведен ингибиторный анализ. Обычно для исследования состояния аквапоринов широко используются ооциты лягушки Xenopus (Daniels et al., 1994; Maurel et al., 1993). Мембраны этих клеток отличаются очень низкой собственной проницаемостью для воды. Мы воспользовались стандартными приемами исследования состояния аквапоринов для работы на целых семенах.

Влияния парахлормеркурий бензоата на набухание семян. ПХМБ в концентрации 5 мкМ практически не влиял на скорость гидратации семян фракции I (необлученных и «улучшенных»). (В такой концентрации ПХМБ не влиял на дыхание, для подавления дыхания используют концентрации на 2 порядка больше.) Однако семена фракции II, в присутствии ингибитора набухали в 1,8-2 раза слабее, чем без ингибитора (рис. 16, кривая +ПХМБ). Если после 4-х часового пребывания в растворе ПХМБ эти семена переносили в 1 мМ раствор дитиотреиэтола (восстановитель SH-групп), то еще через 2 ч скорость поглощения воды семенами полностью восстанавливалась. Это означало, что замедление поступления воды в семена фракции II в присутствии ПХМБ действительно было вызвано закрыванием водных каналов, которые исходно были открыты. Поскольку ПХМБ не влиял на скорость набухания необлученных и «улучшенных» семян, то это могло свидетельствовать о том, что у этих семян во время набухания водные каналы были «закрыты».

Однако на основании этих результатов нельзя решить, были ли водные каналы в мембранах «закрыты» у сухого семени до набухания, или же закрывание происходило во время гидратации мембран.

Влияние NaF (ингибитора фосфатазы) на набухание семян. Если предположить, что водные каналы у сухих семян были «закрыты», то при набухании у семян фракции I состояние каналов не изменяется, а у более слабых семян фракции II в это время каналы «открываются». Если же сухие семена хранились с «открытыми» водными каналами, то в начале набухания у семян фракции I водные каналы в мембранах «закрываются», а у семян фракции II они не «закрываются», по-видимому, из-за повреждения механизма «закрывания».

Известно, что «закрывание» водных каналов у семян - обычно является следствием дефосфорилирования аквапоринов, осуществляемого быстро активируемой во время набухания фосфатазой. Если ее инактивировать NaF, то водные каналы в мембранах не «закроются» и скорость поглощения воды семенами фракции I увеличится. Если же каналы у семян фракции I были «закрыты» до набухания, то ингибирование фосфатазы не изменит скорость их набухания.

В концентрации 100 мкМ NaF не влиял на скорость набухания семян гороха фракции II: за 22 часа прибавка веса составляла, как и в отсутствии NaF, 857 %. В то же время у семян фракции I скорость набухания увеличивалась: прибавка веса возрастала от 635 % (без NaF) до 856 %. Скорость набухания семян фракций I в присутствии NaF становилась одинаковой с таковой у семян фракции II.

Поскольку фторид натрия препятствует «закрыванию» водных каналов, то это свидетельствует о том, что у воздушно-сухих семян фракций I и II водные каналы «открыты». У семян фракции I во время набухания аквапорины дефосфорилируются и каналы закрываются. У семян фракции II водные каналы остаются «открытыми».

Набухание семян в присутствии NaF увеличивало количество быстро набухающих семян с последующим развитием у них гипоксического состояния.

Рис. 21. Фосфоресценция порфиринов у семян гороха из партии 80%-ной всхожести, набухавших в воде (1) и 100 мкМ растворе NaF (2) в течение 22 ч. Семена расположены в порядке нарастания уровня фосфоресценции порфиринов.

Число семян с высоким уровнем фосфоресценции порфиринов возрастало. Если в контроле таких семян было 20%, то в присутствии NaF их количество возрастало втрое (рис. 21). Всхожесть партии семян падала от 80 до 40%.

Важно, что набухание «улучшенных» семян не ускорялось в присутствии NaF, как в случае семян фракции I. Вероятно, у этих сухих семян водные каналы «закрылись» еще до набухания. Поскольку в воздушно-сухом состоянии закрывание водных каналов путем ферментативного дефосфорилирования аквапоринов исключено, то, вероятно, имеет место неферментативный механизм. Так снижение их качества сухих семян при хранении вызывают продукты автоокисления липидов (свободные радикалы, перекиси и альдегиды) и процесс неферментативного гликозилирования белков (амино-карбонильная реакция) [Smith, Berjak, 1995; Sun, Leopold, 1995]. Эти процессы ускоряются под влиянием внешних воздействий [Roberts, Ellis, 1982] и вероятно могут вызвать «закрывание» каналов и появление «улучшенных» семян.