03.00.01-03 - Радиобиология
03.00.02-03 - биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий), определяемое методом замедленной люминесценции
Веселова Татьяна Владимировна
Москва, 2008 г.
Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета Московского Государственного университета им. М.В.Ломоносова
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Бурлакова Елена Борисовна
доктор биологических наук, профессор
Пелевина Ирина Ивановна
доктор биологических наук, акад. РАЕН
Обручева Наталия Владимировна
Ведущая организация - ВНИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии, Обнинск
Защита состоится «__» _______ 200_ г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д.501.00.65 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. ___.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Отзывы просим присылать по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, биологический факультет. Факс (495) 939-11-16
Автореферат разослан «__»__________2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор Кольс О.Р.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Существует проблема разнонаправленного действия больших и малых доз ионизирующей радиации. Если причины повреждающего действия больших доз достаточно хорошо изучены, то вопрос о стимулирующем действии малых доз до сих пор остается открытым, несмотря на многочисленные исследования в этой области [Бреславец, 1946; Кузин, 1995; Преображенская, 1971; Д.М. Гродзинский, Гудков, 1973; Ижик, 1976; Савин, 1981; Д.М. Гродзинский, 1989; Райнхарт, 1998; Miller, Miller, 1987; Sheppard, Regitnig, 1987; Mokobia et al., 2006]. Интерес к проблеме вызван перспективой использования явления радиационной стимуляции растений в сельском хозяйстве с целью увеличения продуктивности растений и получения более высокого урожая.
Большинство работ по радиостимуляции растений выполнено путем облучения элитных семян, результат наблюдают по урожаю. Однако урожай в первую очередь зависит от всхожести семян. Ее уменьшение даже на 10-20% приводит к двух-трех-кратному снижению урожая [Реймерс, 1987].
При хранении семена старятся, качество и всхожесть семян снижаются, поэтому в партии семян, хранившейся несколько лет, присутствуют сильные семена, слабые (живые, но не прорастающие) и мертвые.
Известны приемы предпосевной обработки семян, с помощью которых можно увеличить всхожесть семян, утраченную при хранении. Ионизирующая радиация в малых дозах, озвучивание [Данько и др. 2000], кратковременная тепловая [Priestley, 1986; Реймерс, 1987] и ударно-волновая обработки [Игнатьев, 1976], экспонирование в электрическом и магнитных полях [Аносова и др., 1992; Бондаренко и др., 1998], лазерное облучение [Инюшин, 1978; Числова, 1988], предпосевное замачивание в растворах биологически активных веществ и др. могут увеличить всхожесть семян и урожай на 15-25% [Бреславец, 1946; Преображенская, 1971; Ижик, 1976; Кузин, 1995; Савин, 1981; Гудков, 1985; Д.М.Гродзинский,1989].
Возникает естественный вопрос, каким образом воздушно-сухие семена, которые годами старели, накапливали повреждения и теряли всхожесть, в результате кратковременной предпосевной обработки приобретают способность прорастать. Для того чтобы ответить на этот вопрос, надо, прежде всего, иметь представление, какие изменения в стареющих семенах приводят к снижению всхожести - появлению не прорастающих, но живых семян. Всхожесть может быть увеличена только за счет этих семян.
Старение и гибель семян обусловлены нарушением целостности клеточных мембран и повреждением ДНК [обзоры, Priestley, 1986; Bewley, Black, 1994; Smith, Berjak, 1995]. Предполагают, что это вызвано продуктами свободнорадикального перекисного окисления мембранных липидов. Процесс старения семян уподабливают окислительному стрессу [Stewart, Bewley, 1980; Barber, 1984; Thompson et al., 1987; Senaratna, et al,. 1988; Hendry, 19975; Simontacchi, Puntarulo, 1994; Smith, Berjak, 1995]. В последние годы обратили внимание на то, что старение семян, как и животных и человека, сопряжено с процессом неферментативного гликозилирования белков и нуклеиновых кислот (реакция Амадори-Майларда) [Серами и др., 1987; Растинг, 1993; Sun, Leopold, 1995].
Существует гипотезы, объясняющие стимуляцию жизнедеятельности растительного организма, слабыми воздействиями. Одна из них предполагает, что уровень метаболизма возрастает из-за ослабления контроля со стороны регуляторных механизмов, которые в норме ограничивают функциональную активность клетки [Александров, 1985], то есть имеет место проявления правила Арндта-Шульца. Согласно другой распространенной гипотезе стимуляция роста и развития растения трактуется как следствие гиперфункции репарационных процессов в ответ на первоначальное повреждение и появление малых количеств клеточных токсинов [Бреславец, 1946; Тимофеев-Ресовский, 1956; Д.М. Гродзинский, Гудков, 1973; Савин, 1981; Д.М. Гродзинский, 1989; Кузин, 1995].
У организмов в состоянии метаболического покоя (воздушно-сухие семена, пыльца, споры и др.) считают, что облучение в малых дозах и другие физические воздействия оставляют в клетках скрытые (потенциальные) повреждения, которые реализуются во время перехода клеток в жизнедеятельное состояние [Кузин, 1995]. Естественно, что предполагаемые механизмы стимуляции могут включаться у семян только во время их прорастания. Но еще до набухания в облученном семени развиваются пострадиационные физико-химические процессы. Так, после больших доз облучения состояние семян в процессе хранения ухудшается, они теряют всхожесть («эффект хранения»). Эффект стимуляции растений из семян, облученных в малых дозах, при затягивании сроков высева пропадает.
Для стимуляции всхожести воздействию обычно подвергают неоднородные партии хранящихся семян, состоящие из сильных, слабых и мертвых. Поскольку увеличить всхожести партии семян можно лишь за счет живых семян, не прораста-ющих при данных условиях, то для исследования механизма стимулирующего действия ?-радиации и других факторов необходимо иметь воздушно-сухие семена однородные по качеству. Но задача деления партии таких семян на фракции разного качества до проращивания до сих пор практически не была решена.
Цель и задачи исследования
Целью работы было выяснить механизм изменения всхожести семян при их хранении и под действие внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий).
В задачи работы входило:
разработка люминесцентного метода анализа качественного состава партий воздушно-сухих семян и прогнозирования их всхожести без проращивания;
установление взаимосвязи между люминесцентными характеристиками индивидуальных сухих семян и качеством вырастающих из них проростков;
исследование влияния ионизирующей радиации и других факторов, в обычно используемых для стимуляции всхожести, на качественный состав партии сухих семян; люминесценция семена всхожесть излучение
выяснение причины, препятствующей прорастанию ослабленных семян и роли окислительного стресса в образовании проростков с морфологическими дефектами;
исследование динамики всхожести семян в период после действия на семена ионизирующего излучения и тепловой обработки.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Изменение всхожести семян под влиянием ионизирующего излучения, тепловой обработки, и других физических факторов (озвучивание, механические воздействия, лазерное облучение, электрические и магнитные поля) является неспецифическим ответом, который определяется, в основном, процессами, происходящими в сухих семенах до проращивания.
2. Кратковременная стимуляция всхожести семян под влиянием физических факторов разной природы обусловлена ускорением процесса естественного старения (накопления повреждений).
Научная новизна работы. Впервые показано, что при помощи регистрации фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ) у воздушно-сухих семян до проращивания можно прогнозировать изменение всхожести после предпосевной обработки факторами различной природы в малых дозах (тепловое, ионизирующее излучение, акустическое воздействие, электрическое поле коронного разряда, комбинированное магнитное поле, лазерное излучение).
Измерение уровня ФКТ индивидуальных сухих семян (злаковых, бобовых, огурцов, сосны) и анализ распределения семян по уровню ФКТ впервые позволило разделять партии воздушно-сухих семян пониженной всхожести на три дискретных фракции, отличающихся по качеству.
Повышение всхожести партии можно прогнозировать по распределению сухих семян по ФКТ, если воздействие вызывает увеличение доли семян во фракции I (всхожих) за счет их перехода из фракции II (живых, но невсхожих).
Причиной стимуляции всхожести семян бобовых низкого качества после облучения и других воздействий в малых дозах является модификация клеточных мембран, которая сопровождается замедлением поступления воды в клетки при набухании.
Впервые показано, что, регистрируя фосфоресценцию эндогенных порфиринов у набухающих семян можно оценивать уровень дефицита кислорода под семенной оболочкой.
Нарушение процесса деления у ненормальных проростков было следствием пост-гипоксического окислительного стресса после проклевывания семян. При доступе воздуха к зародышу после гипоксии наблюдали образование активных форм кислорода, в основном, Н2О2, при аэрации семян после гипоксии наблюдали хемилюминесцентным методом в присутствии люминола. Отсутствие гипоксии у семян, из которых вырастают нормальные проростки, обусловлено их более медленным набуханием, при котором потребление кислорода при дыхании зародыша компенсируется его диффузией через оболочку семена.
Анализ уровня ядерной ДНК при подготовке клеток зародышевой оси к делению (переход 2С4С) показал, что у семян фракции II торможение репликации ДНК совпадает во времени с возрастанием количества Н2О2.
Практическое значение работы.
Разработан экспрессный метод, основанный на явлении фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ), для определения такого важного показателя качества семян как влажность (А.с. № 1047431, 1981). Метод позволяет оценить разницу во влажности образцов в 0,1-0,2% у семян и биопрепаратов (муки, крупы, конидий и др.) при содержании в них воды от 4 до 20% от сырого веса.
Регистрация ФКТ индивидуальных воздушно-сухих семян позволяет характеризовать гетерогенность партии семян по влажности. Метод может быть рекомендован для выделения из партии ослабленных и мертвых семян.
С помощью метода ФКТ можно наблюдать последействие факторов разной природы на воздушно-сухие семена до их проращивания и контролировать жизнеспособность семян (А.с. № 1131488, 1982).
Разработан метод выделения из партии элитных семян огурцов семян, имеющих высокую потенциальную продуктивность (максимальный урожай) (А.с. № 1570681, 1988).
Разработан метод контроля гипоксии у прорастающих семян, основанный на регистрации фосфоресценции эндогенных порфиринов. Показано, что набухание семян в присутствии антиоксидантов (например, пропилгаллата) уменьшает повреждение зародыша при пост-гипоксическом окислительном стрессе и увеличивает всхожесть семян.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на: Межфакультетской научно-практической конференции “МГУ - сельскому хозяйству”, 1982 (Москва); отчете по программе сотрудничества стран-членов СЭВ и СФРЮ по проблеме исследования в области биологической физики, 1984 (Пущино), Первой республиканской конференции по биофизике Молдавии, 1984 (Кишинев); Всесоюзном научном совещании “Люминесцентные методы исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности”, 1985 (Минск); Всесоюзном симпозиуме “Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве”, 1986 (Ташкент); Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур, 1988 (Алма-Ата); Всесоюзном симпозиуме “Физиология семян”, 1988 (Душанбе); Всесоюзной конференции “Измерительная и вычислительная техника в управлении производственными процессами в АПК”, 1988 (Ленинград); Симпозиуме Интернациональной ассоциации по тестированию семян “Технологический прогресс и исследования семян”, 1994 (Вагенинген, Голландия); III съезде общества физиологов России “Физико-химические проблемы физиологии растений”, 1996 (Пенза); II Международном научно-практическом симпозиуме по селекции и семеноводству, 1997 (Аранжелович, Югославия); Международной школе “Проблемы теоретической биофизики”, 1999 (Москва); II Съезде Биофизиков России, Москва, мгу, 1999; IV съезде общества физиологов растений России “Физиология растений - наука III тысячелетия”, 1999 (Москва); Международной научно-практической конференции «Семя», 1999 (Москва); Школе-конференции “Горизонты физико-химической биологии”, 2000 (Пущино-на-Оке); Международной конференции “Растения под стрессом окружающей среды”, 2001 (Москва); V конференции “Кислород, свободные радикалы и окислительный стресс у растений”, 2001 (Ницца, Франция); VII международном рабочем совещании по семенам, 2002 (Саламанка, Испания); Международной конференции “Семена древесных”, 2002 (Ханья, Греция); Международном рабочем совещании “Новые достижения в улучшении качества семян”, 2003 (Лодзь, Польша).