Автореферат: Изменение состояния семян при их хранении, проращивании и под действием внешних факторов (ионизирующего излучения в малых дозах и других слабых воздействий), определяемое методом замедленной люминесценции

III.2.10. Изменения всхожести семян при хранении. Мы предположили, что у семян, всхожесть которых упала сразу после воздействия (увеличение фракции II), при дальнейшем хранении она может возрасти (появятся «улучшенные» семена). Это предположение подтверждают нижеприведенные наблюдения.

Мы обнаружили, что при хранении семян гороха сорта Немчиновский-85 в производственных условиях их всхожесть изменяется немонотонно (рис. 22, кривая 1). После 4-х лет хранения всхожесть семян уменьшилась с 93 до 73%. Однако еще через год всхожесть оказалась равной исходной. В последующие годы она опять уменьшалась и после 8 лет хранения семена практически все были невсхожими.

Рис. 22. Всхожесть семян гороха (1) и содержание глюкозы в них (2).

Чтобы проверить, не связано ли изменение всхожести с качеством семян разных лет урожая, мы проверили, как изменяется всхожесть семян одного года урожая при хранении после теплового воздействия (40ОС, 85% относительная влажность воздуха).

Изменение всхожести семян гороха при хранении после теплового воздействия тоже было не монотонным (табл. 3).

Таблица 3. Всхожесть семян гороха через неделю и через 7 месяцев после разной продолжительности теплового воздействия (40ОС, 85% относит. влажность воздуха)

Всхожесть контрольных семян (0 суток тепловой обработки) в течение 7 месяцев практически не изменилась. Если всхожесть семян определяли через неделю после 5-7 суточной тепловой обработки, то она падала до 22-24%. Однако после 7 месяцев хранения всхожесть у тех же семян возрастала (до 40-44%) по сравнению с определенной через неделю после обработки. То есть хранение семян, у которых всхожесть была понижена тепловой обработкой приводит к увеличению их всхожести.

У семян, всхожесть которых через неделю после 9 суток тепловой обработки возрастала по сравнению с исходной на 10%, после 7 месяцев хранения она, напротив, упала до 8%. Хранение семян после тепловой обработки в стимулирующей дозе, приводит не только к исчезновению эффекта стимуляции, но и к более быстрой гибели, по сравнению с контрольными семенами.

Изменение всхожести семян гороха при хранении после ?-облучения. Всхожесть семян, облученных в дозе 190 мГр, сначала постепенно уменьшалась в течение первых 2-х месяцев хранения, но к 5-ому месяцу восстановилась до уровня необлученных семян (рис. 23, кривая 2). После облучения семян в дозе 3 Гр она снижалась быстрее, но затем тоже восстанавливалась и через пять месяцев хранения всхожесть семян была даже выше исходной (кривая 3).

Рис. 23. Всхожесть семян гороха (число нормальных проростков) в разные сроки после облучения в дозах 0 Гр (1), 190 мГр (2), 3 Гр (3) и 10 Гр (4).

Спустя две недели после облучения в дозе 10 Гр всхожесть семян, которая через неделю после облучения мало отличалась от всхожести необлученных семян, снижалась быстрее, чем всхожесть необлученных семян и после 5 месяцев хранения была вдвое ниже контрольной (кривая 4).

То есть при хранении семян в зависимости от дозы облучения можно наблюдать разнонаправленные изменения всхожести. У семян, всхожесть которых была снижена ионизирующим облучением в малой дозе, происходит ее восстановление и даже некоторая стимуляция по сравнению с изменением всхожести необлученных семян. У семян, всхожесть которых или мало отличалась от исходной или была несколько повышенной после облучения в несколько больших дозах, при хранении, наблюдали только однонаправленное ее снижение по сравнению с контролем.

Однако, анализ распределений сухих семян по уровню ФКТ показал, что и при дозе облучения 10 Гр есть фаза, когда через двое суток после облучения уменьшилась почти вдвое доля семян во фракции I и выросла доля семян фракции II (рис. 24, кривая 2). Такое измерение распределения сухих семян обычно характерно для снижения всхожести. Спустя 4-6 суток после облучения вновь распределение стало унимодальным (кривая 3), возросло число семян во фракции I за счет уменьшения их во фракции II. Уровень ФКТ регистрировали у одних и тех же семян, помещенных в индивидуальные номерованные ячейки. Можно было наблюдать, как у некоторых семян фракции I при регистрации ФКТ через двое суток после облучения, уровень свечения возрос приблизительно вдвое, а спустя 4 суток после облучения снизился практически до исходного.

Рис. 24. Распределение семян гороха по уровню ФКТ во времени после облучения в дозе 0 и 10 Гр. Семена через 2 (2) и 4 сут (3) и через 2 мес (4) после облучения.

Иными словами, как в случае естественного старения и тепловой обработки, так и при хранении облученных семян, наблюдаются начальное снижение всхожести, ее последующее возрастание до исходно уровня или даже выше его (стимуляция), и окончательное падение при появлении мертвых семян.

III.2.11. Возможный механизм стимуляции всхожести семян под действием внешних факторов. Мы показали выше, что снижение всхожести обусловлено появлением семян фракции II, для которых характерно быстрое набухание, гипоксия под оболочкой и постгипоксический окислительный стресс. Более быстрое поглощение воды семенами фракции II объяснили тем, что аквапориновые каналы при набухании этих семян, в отличие от семян фракции I, остаются открытыми.

В литературе принято, что возрастание проницаемости клеточных мембран для воды и электролитов при снижении качества семян вызвано изменением фазового состояния липидного бислоя мембран вследствие перекисного окисления фосфолипидов [Harrington, 1973; Senaratna et al., 1988; Smith, Berjak, 1995]. Если у семян фракции II увеличение скорости набухания обусловлено не только состоянием водных каналов, но и изменением липидной фазы мембран, то при закрывании каналов препаратами ртути скорость набухания семян фракции II должна была бы быть выше, чем у семян фракции I. Однако у семян фракции I, «улучшенных» семян и семян фракции II с блокированными ртутью каналами скорости набухания одинаковы. Поэтому маловероятно, что за переходы семян из фракции I во фракцию II и последующее «превращение» семян в «улучшенные» ответственно изменение липидной фазы мембран.

Мы не смогли термохемилюминесцентным (ТХЛ) методом зарегистрировать у семян фракций I, II и «улучшенных» продукты перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот. Свечение в области температур 60-90ОС наблюдали только у семян фракции III, то есть продукты перекисного окисления присутствуют только в порошке из мертвых семян. Именно у последних резко возрастает проницаемость мембран для воды и ионов.

Нам кажется, что многочисленные факты обнаружения продуктов перекисного окисления липидов в стареющих популяциях семян являются результатом использования выборки сухих семян, которая содержит семена разного качества, включая, мертвые. Например, опыты [Senaratna et al., 1988] выполнены на семенах сои 13%-ной всхожести. В наших экспериментах оценивали содержание перекисных продуктов у семян разных по качеству фракций.

Переход воздушно-сухих семян из фракции I во фракцию II при тепловом воздействии и облучении, отражающий уменьшение влажности происходят достаточно быстро - в течение суток-двух. При исходной влажности семян гороха 9,9% (вся вода связанная), она уменьшается примерно на 0,6-0,8%. Допустить, что содержание воды в семенах уменьшается за счет ее испарения в окружающую среду маловероятно, поскольку для установления равновесной влажности необходимы большие сроки (неделя и более). Например, семена были увлажнены до 11%, затем их поместили в эксикатор с относительной влажностью воздуха 43%. Равновесная влажность устанавливалась у мертвых семян через 3 сут, у семян фракции II - за 8 сут, а семян фракции I -за 20 сут. В то же время после ?- облучения в дозе 10 Гр переход семян из фракции I во фракцию II (со снижением содержания воды) происходил за двое суток. А при дозе 3 Гр для перехода было необходимо 4 сут при относительной влажности воздуха 60%. То есть уменьшение содержания воды в семенах после облучения происходило гораздо быстрее, чем ее потеря испарением. Поэтому можно предположить, что снижение содержания воды в семенах происходит во время гидролиза олигосахаридов, который происходит в семенах при хранении [Bernal-Lugo, Leopold, 1992; Locher, Bucheli, 1998; Zalewski, Lahuta, 1998]. При гидролизе полисахаридов происходит внутриклеточное перераспределение воды: некоторая доля связанной воды включается в структуру продуктов (в виде атома Н или группы ОН). Сопоставление суммарного молекулярного веса продуктов гидролиза олигосахарида, например, сахарозы, и ее исходного молекулярного веса подтверждает это предположение (180 + 180 =342 + 18).

Используя данные работы [Locher, Bucheli, 1998] о деградации олигосахаридов в семенах сои при хранении, мы рассчитали, насколько может измениться влажность семян за счет неферментативного гидролиза олигосахаридов. Расчеты показали, что при гидролизе 50,07 мг/г олигосахаридов (вербаскозы, стахиозы, раффинозы и сахарозы) влажность семян должна снизиться на 0,4-0,5%. Эта величина такого же порядка, что и снижение влажности семян гороха при переходе из фракции I во фракцию II. Поэтому можно предположить, что переход воздушно-сухих семян во фракцию II и уменьшение их влажности вызваны гидролизом олигосахаридов, при котором возрастает количество глюкозы. Мы измерили содержание глюкозы в семенах фракций I, II и «улучшенных». Измерение проводили в порошке сухих семян термохемилюминесцентным методом по уровню свечения при 145-150ОС, и глюкометром в супернатанте гомогената порошка в дистиллированной воде.

Таблица 4. Содержание глюкозы в семенах гороха разных фракций

Действительно, оба метода показали, что семена фракции II содержат в 2-3 раза больше глюкозы, чем семена фракции I (табл. 4).

Кроме того, оказалось, что содержание глюкозы у семян гороха после 4 лет хранения, когда всхожесть снижалась из-за увеличения доли второй фракции, тоже возрастало вдвое по сравнению с исходными семенами (рис. 22, кривая 2). Когда всхожесть семян после 8 лет хранения приближалась к нулевой, содержание глюкозы возрастало в десятки раз. Этот факт согласуется с данными других авторов, исследовавших гидролиз олигосахаридов при старении семян [Bernal-Lugo, Leopold, 1992; Sun, Leopold, 1995; Horbowicz, 1997; Locher, Bucheli, 1998; Zaliwski, Lahuta, 1998; Murthy et al., 2003].

Появление семян фракции II в партиях, облученных в дозах 190 мГр и 3 Гр, тоже сопровождалось увеличением содержания глюкозы у облученных семян по сравнению с необлученными (табл. 5). После летальной дозы облучения 100 Гр количество глюкозы в семенах возрастало в 5 раз.

Возникшие в семенах при неферментативном гидролизе восстанавлияющие сахара активно вступают в реакции с белками и аминокислотами - амино-карбонильную реакцию или реакцию гликозилирования. В последние годы роль амино-карбонильной реакции (Амадори-Майларда) в старении не только семян [Wettlaufer, Leopold, 1991; Sun, Leopold, 1995; Murthy, Sun, 2000; Murthy et al., 2003], но и животных и человека активно обсуждается [Серами и др., 1987; Растинг, 1993]. Отмечают, что малое содержание восстанавливающих сахаров в сухих семенах является защитой от неферментативной амино-карбонильной реакции, которая активно протекает в области влажностей от 6 до 15%.

Таблица 5. Содержание глюкозы в воздушно-сухих семенах гороха

через неделю после ?-облучения

Переход семян из фракции II в разряд «улучшенных», сопровождающийся возрастанием влажности семян, совершается также быстро - в течение одних-трех суток (время последействия - «отлежка»). В качестве возможного объяснения увеличения содержания воды в сухом семени можно предположить реакцию гликозилирования (амино-карбонильную реакцию), в которой при взаимодействии гидроксила глюкозы с концевой аминогруппой белка образуется глюкозиламин и отщепляется молекула воды. Образовавшийся гликопротеин становится более гидрофильным [Wettlaufer, Leopold, 1991]. Снижение содержания глюкозы коррелирует с возрастанием всхожести семян после пяти лет хранения (рис. 21, кривая 2), а также стимуляцией всхожести семян после ?-облучения в дозах 7 и 10 Гр (табл. 5).

Мы предполагаем, что именно эта неферментативная реакция ответственна за «закрывание» водных каналов в сухих семенах и стимуляцию всхожести семян. К выводу о стимулирующей роли продуктов гликозилирования белков (Амадори продукты) могли бы прийти и Wettlaufer и Leopold [1991], которые привели данные о параллельном увеличении продуктов Амадори и всхожести семян сои, однако этот факт они не обсуждают. Уменьшение содержания свободной глюкозы при «улучшении» качества семян подтверждает наше предположение (табл. 4, 5) о том, что в «закрывании» водных каналов может участвовать реакция гликозилирования. В литературе также отмечают, что гликозилирование является одной из реакций, влияющей на активность аквапоринов [обзор, Шапигузов, 2004].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нам удалось разработать метод оценки качества индивидуальных семян, основанный на регистрации ФКТ, который позволил оценивать гетерогенность семян в партии по содержанию воды в них.

Оказалось, что изменение качества семян при постепенном накоплении повреждений изменяется не плавно, а скачком. Нам удалось показать, что снижение всхожести (переход семян в разряд невсхожих), или ее стимуляцию (переход семян в разряд всхожих) под влиянием внешних воздействий можно обнаружить на сухих семенах без проращивания, регистрируя их фосфоресценцию при комнатной температуре (ФКТ).

В сухих семенах, перешедших за время хранения, а также под влиянием внешних воздействий (?-облучение, или тепловая обработка) во фракцию II (невсхожих), увеличивается вдвое содержание продукта гидролиза олигосахаридов - глюкозы. Влажность таких семян снижается на 0,8-1%, что связано с использованием воды в процессе гидролиза. Одновременно у этих семян происходит инактивация фосфатазы, что свидетельствует о нарушении регуляторной функции водных каналов. У семян фракции II на ранних стадиях набухания аквапорины клеточных мембран не закрываются, и скорость поступления воды в семена при набухании возрастает. Активное поглощение кислорода при митохондриальном дыхании и слабой диффузии кислорода через оболочку приводит к развитию гипоксии. При проклевывании зародышевого корешка (его контакте с воздухом) возникает постгипоксический окислительный стресс, сопровождающийся накоплением перекиси водорода, которая повреждает ДНК. Это приводит к образованию проростков с морфологическими дефектами и снижению всхожести.