Публикации. По материалам диссертации опубликовано в 46 печатных работах, в том числе: 2 монографии, 17 статей в журналах из списка ВАК, 7 работ в рецензируемых журналах, 4 авторских свидетельства, 7 статей в сборниках, и 10 тезисов.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на ___ стр. машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания объектов и методов исследования (как стандартных, так и разработка новых) (глава II), изложения полученных результатов (глава III), их обсуждения (глава -IV) выводов, списка литературы и приложения. Текст иллюстрирован 18 таблицами и 75 рисунками. Список литературы включает 159 отечественных и 271 зарубежных работ.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении дано обоснование актуальности выбранной темы в связи с имеющимися на сегодняшний день исследованиями по стимуляции жизнедеятельности растений после действия ионизирующего излучения в малых дозах и действия других факторов. Сформулированы цели и задачи исследования.
В обзоре литературы (глава I), состоящем из четырех разделов, представлен обзор данных о радиостимуляции, предполагаемых механизмах повышения всхожести семян под влиянием различных факторов, возможных механизмах потери всхожести семенами при старении. Обсуждается взаимосвязь между состоянием мембран семян и их всхожестью. Дан обзор методов, которые можно использовать для индивидуальной оценки качества семян.
II. Объекты и методы исследования
II.1. Объекты. Большая часть исследования проведена на семенах гороха (`Немчиновский-85 и др.) и сои (`Букурия' и др.). Кроме того, в работе использовали семена пшеницы, ржи, ячменя (`Рядовой'), огурцов (`Московский тепличный'), перца, подсолнечника, кукурузы, фасоли и сосны.
II.2. Всхожесть семян определяли стандартным способом (правила ISTA - Международной ассоциации оценки качества семян, 1996). Под всхожестью партии понимают процент семян, из которых вырастают нормальные проростки. Не прорастающие семена и семена, из которых вырастают проростки с морфологическими дефектами, считаются невсхожими.
II.3. Выход электролитов из семян измеряли после 1,5 ч экспонирования индивидуального семени в 2 мл дистиллированной воды. Электропроводность среды определяли бесконтактным методом при помощи Oscillotitrator OK-302.
II.3. Действующие факторы:
II.3.1. Семена гороха подвергали воздействию ??излучения в Объединенном институте ядерных исследований (Дубна) на установке ROKUS-M при мощности дозы 0,913 Гр/мин на расстоянии 75 см от источника. Дозу подбирали, варьируя время облучения (1 Гр - 65,78 с). Для облучения семян в дозе 190 мГр использовали источник ?-квантов 60Со (Е37) P0=0.362 Р/час/м (мощность дозы облучения - 5,7 мГр/час, расстояние 80 см, время облучения - 1/3 часа). Были выбраны 3 уровня доз: сверхмалая доза 190 мГр (использована для выявления ранних цитогенетических эффектов [Корогодина и др., 2004]), стимулирующие дозы для наблюдения радиационного гормезиса 3-10 Гр, и летальная доза 100 Гр.
II.3.2. Тепловую обработку семян проводили двумя способами. 1. Прогревание при 400С и 85% относительной влажности воздуха (так называемое «ускоренное старение»). 2. Прогревание при 40ОС герметично упакованных семян, влажность которых предварительно была увеличена до фиксированного значения («контролируемое повреждение»).
II.3.3. Лазерное облучение элитных семян огурцов проводили на вращающемся зеркальном диске в сухом затемненном помещении при температуре 20-250С. Использовали гелий-неоновый лазер ЛГ-75 (?=632,5 плотностью мощности 0,3 мВт/см2) дозами 100-150 импульсов (1 импульс 50 мкДж/см2). (Облученные семена были предоставлены Р.С.Бахтияровым).
II.3.4. Звуковую обработку выборки семян ячменя (от 100 до 500 шт) проводили в чашке Петри в течение 5 минут с помощью источника акустических волн (Звуковой генератор) мощностью 65 дБел с регулируемой частотой (с точностью 1 Гц). (Озвученные семена были предоставлены В.В.Егоровым).
II.3.5. Семена овса, подвергнутые светоимпульсному облучению (0,5 с, 50 МВт), и семена пшеницы после обработки электрическим полем коронного разряда (0,5 с, 2кВт/см2) с целью повышения их всхожести были получены из Всесоюзного НИИ экспериментальной физики (г. Саров).
II.4. Влажность семян определяли весовым способом по правилам ISTA [1996]. Сухие семена размалывали, быстро формировали из муки семян три навески по ~5 г и помещали в сушильный шкаф с 1050С на 3-5 часов до достижения постоянного веса. В дальнейшем закрытые бюксы с семенами охлаждали при комнатной температуре. После остывания семена взвешивали и рассчитывали влажность, как изменение веса после подсушивания, отнесенное к исходному весу.
II.5. Поглощение кислорода индивидуальными семенами или выделенными зародышевыми осями определяли полярографически при 20ОС электродом типа Кларка Электрод E5047, фирмы Radiometer A/S Denmark. Диаметр платинового электрода 20 мкм. Зародышевые оси инкубировали в камере с водой объемом 60 мкл. После того, как при дыхании зародыша или зародышевых соей концентрация кислорода в воде снижалась до нуля, камеру вновь заполняли водой и регистрировали дыхание. Процедуру повторяли 4-4 раза.
II.6. Анализ содержания ядерной ДНК проводили стандартным методом [Redfearn et al., 1995] в нашей модификации. Для анализа 2-мм отрезки апикальной части зародышевой оси растирали в буфере для выделения (0,2 М маннит, 10 мМ Мес-буфер, 10 мМ NaCl, 10 мM спермин-тетрагидрохлорид, 2,5 мМ Na2-ЭДТА, 0,05 об/об Тритон Х-100, рН 5,8). В суспензию добавляли 10 мкл 5 мг/мл этидиум бромида - специфического флуоресцентного (ФЛ) красителя ДНК, уровень ФЛ которого пропорционален количеству ДНК в клетке (2С, 4С, 8С). ФЛ регистрировали на микрофлуорометрическом анализаторе. 10 мкл суспензии помещали на предметное стекло люминесцентного микроскопа (ЛЮМАМ 13) с видеокамерой (QX3, Intel, США). Сигнал анализировали с помощью компьютерной программы, разработанной С.В.Гальчуком и В.Б.Туровецким. Интенсивность ФЛ измеряли у 600-800 ядер (25-80 ядер на каждом стекле) для каждой экспериментальной точки.
II.7. Определение состояния ДНК. Пятнадцать пятимиллиметровых кончиков зародышевых осей размалывали в жидком азоте с лизирующим раствором (50 мМ Трис-HCl буфер (рН 7,5), 25 мМ ЭДТА, 1% СДС). Смесь инкубировали 30 минут при комнатной температуре. После добавления NaCl до 1 М концентрации смесь была депротеинизирована встряхиванием с хлороформ/спиртовым раствором (10/1 об/об). После центрифугирования в течение 10 минут при 5000 g, ДНК была выделена из жидкой фазы добавлением тройного объема этанола (96%) и растворена в 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7,5), содержащем 25 мМ ЭДТА. Образцы ДНК были обработаны рибонуклеазой А, не содержащей ДНКазы (50 мкМ/мл) в течение 20 мин при 370С и затем ДНК снова осаждена добавлением тройного объема этанола (96%). Одинаковые объемы изолированной и очищенной ДНК были электрофоретически разделены в течение 2 часов в 1,2% агарозном геле при напряжении 2,3 В/см в 0,09 М Трис-боратном буфере (рН 8,3), содержащем 0,5 мкМ/мл этидиум бромида (эту работу проводили совместно с лабораторией чл-корр. Б.Ф. Ванюшина, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ).
II.8. Хемилюминесценцию эмбриональных осей семян гороха измеряли в присутствии 5.10-5М хемилюминесцентного индикатора люминола. Свечение регистрировали на хемилюминометре с одноэлектронным счетом фотонов. Сигнал от фотоумножителя (ФЭУ-85), чувствительного в видимой области спектра, поступал на усилитель, а затем на самописец. Образцы во время измерения находились в термостатируемой камере. Растворы каталазы (2000 U/мг, Сигма, США) и антиоксидантов (пропилгаллат [10-4М] и ?-меркаптоэтиламина [10-3М] использовали в качестве ингибиторов активных форм кислорода.
II.9. Термохемилюминесценцию регистрировали на этом же хемилюминометре, сигнал с которого поступал на компьютер.
II.10. Фосфоресценцию при комнатной температуре воздушно-сухих и набухающих семян регистрировали на установке с двухдисковым фосфороскопом. Объект освещали импульсами видимого света (6 мс свет, 24 мс темнота) от галогенной лампы КГМ-150. Послесвечение регистрировали в интервале 3-18 мс после прекращения освещения в видимой части спектра. Сигнал с фотоумножителя поступал сначала на усилитель (рН-340), а затем на самописец. Кинетику затухания свечения регистрировали в миллисекундной временной области.
II.11. Содержание глюкозы в семенах гороха оценивали двумя независимыми методами: глюкометром (Gluco care, Венгрия) и по уровню термохемилюминесценции при 150ОС (метод разработан нами).
II.12. Интенсивность синтеза белка определяли по включению меченого [35S]метионина в белки осевых органов семян гороха в течение 3-х часов набухания согласно рекомендации [Гумилевская и др., 1996].
Повторность опытов 3-5-кратная. Статистическую обработку результатов при оценке средних значений по выборке проводили с помощью программ статистической обработки данных: определяли средние значения, среднее квадратичное отклонение и дисперсию; использовали корреляционный анализ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Качество семян при хранении ухудшается. Из состарившихся семян наряду с нормальными проростками вырастают проростки с морфологическими дефектами (ненормальные), а часть живых семян, как и мертвые, не наклевываются вовсе [Isoly, 1957]. В период прорастания семена особенно чувствительны к внешним факторам, и потому их всхожесть в большой степени зависит от условий набухания, в частности от скорости поступления воды в семена и температуры [Priestley, 1986; Vertucci, 1989]. Старые семена больше подвержены повреждениям по сравнению с молодыми Vertucci, Farant, 1995; Obroucheva, 1999]. Быстрое поступление воды в клетки сухого зародыша может механически разрушить клетки [Larsson, 1968; Hoekstra et al., 2001].
При набухании у семян возникает кратковременная гипоксия, которую семена обычно благополучно переживают [Джеймс, 1956]. Причиной гипоксия у крупных семян бобовых может быть высокая скорость поглощения кислорода зародышем и медленная диффузия газа внутрь семени через семенную оболочку, поскольку семенная кожура препятствует поступлению к зародышу достаточного количества атмосферного кислорода, особенно в избыточном количестве воды [Crawford, 1977; Duke, Kakefuda, 1981; Rolletschek et al., 2002].
Вода поступает в клетки семян путем диффузии через липидный бислой и по специальным каналам, образуемым белками аквапоринами [Maurel et al., 1995, 1997; Schuurmans et al., 2003]. Они формируются на поздних стадиях созревания и регулируют поступление воды в клетки семян при набухании [Johansson et al., 1998; Chrispeels et al., 1999]. Скорость водного транспорта через каналы, образуемые аквапоринами, зависит от их количества и состояния (открыты или закрыты). В фосфорилированном состоянии каналы «открыты» и закрываются при дефосфорилировании, которая осуществляет фосфатаза. Инактивация фосфатазы не дает каналам закрываться [Maurel et.al., 1995; Johansson et.al., 1998]. Препараты ртути (парахлормеркурий бензоат и HgCl2) являются специфическими ингибиторами аквапоринов. Они связываются с цистеином-187 белка аквапорина, стерически закрывают канал, и тормозят поступление воды в клетки. Состояние каналов восстанавливается при отмывании семян восстановителем тиоловых групп дитиотрейэтолом [Maurel, 1997; Javot, Maurel, 2002]. На участие аквапоринов в набухании семян указывает малая зависимость этого процесса от температуры (энергия активации прохождения воды через аквапорины меньше 5 ккал/М, а диффузии через липидный бислой - 12-14 ккал/M) [Maurel, 1997].
Однако изучение взаимодействия этих факторов, определяющих в совокупности состояние семян при их хранении и при разных воздействиях требует разработки специального метода, который мог бы давать интегральную оценку состояния семени на всех этапах хранения и при прорастании в режиме реального времени.
III.1. Разработка методов оценки качества индивидуальных семян
Популяция хранящихся семян содержит семена, из которых вырастают нормальные проростки (они определяют всхожесть партии), проростки с морфологическими дефектами (ненормальные проростки, которые по ГОСТу не считаются всхожими), и мертвые.
Во время хранения семена стареют, и качественный состав партии меняется (рис. 1). Вначале уменьшение числа всхожих семян обусловлено увеличением числа ослабленных, из которых вырастают проростки с морфологическими дефектами. Очевидно, что повысить всхожесть партии семян можно только за счет воздействия на ослабленные семена. Для изучения механизма «улучшения» такие семена необходимо отобрать из партии еще до проращивания. К началу нашей работы не существовало методов, которые позволили ли бы это делать.
Рис. 1. Схематическое представление изменения доли всхожих (cветлые части столбиков), ослабленных (заштрихованные) и мертвых (черные) семян во время хранения [Bewley, Black, 1994].
О качестве семян обычно судят по качеству вырастающих из них проростков, а жизнеспособность определяют окрашиванием набухших семян витальными красителями и по выходу электролитов в дистиллированную воду. Каждую из процедур можно проводить только один раз, поэтому для выяснения изменений качества семян при хранении используют популяционно-статистический подход. Мы разработали метод неповреждающего контроля качества индиивидуальных сухих семян.
III.1.1. Качество воздушно-сухих семян. Воздушно-сухие семена после освещения видимым светом обладают длительным послесвечением, которое затухает в течение многих минут [Веселова и др., 1985а, б]. Кинетика затухания свечения многокомпонентная. При регистрации свечения с помощью фосфороскопа в миллисекундной области, оно, в основном, представлено двумя компонентами со временами жизни 1-3 и 12-20 мс.
Известно, что длительное свечение различных органических веществ, характеризуется свойствами, включающее линейную зависимость от интенсивности возбуждающего света, снижение при повышении температуры, в присутствии кислорода и повышении влажности, активируемое в присутствии ионов тяжелых металлов. Оно является фосфоресценцией с триплетного уровня при комнатной температуре [Parker et al., 1980, a, b]. Полученные нами характеристики свечения воздушно-сухих семян оказались сходными с таковыми для фосфоресценции органических соединений при комнатной температуре. На основании этого мы пришли к выводу, что свечение семян также является фосфоресценцией при комнатной температуре (ФКТ). Измеренный нами спектр свечения ФКТ воздушно-сухих семян широкий, неструктурированный (рис. 2, кривая 1) и, скорее всего, представляет собой сумму спектров свечения различных веществ: продуктов распада хлорофилла -