Рис. 2. Спектр ФКТ воздушно-сухих семян (1) и спектры излучения (2) и возбуждения (3) свечения набухающих семян гороха.
порфиринов, целлюлозы, и флавинов, которых много в семенах. Оказалось, что характер спектра свечения меняется в зависимости от состояния семян. В отличие от широкого неструктурированного спектра ФКТ сухих семян, спектр свечения набухающих семян имеет четыре четко выраженных максимума, характерных для спектры фосфоресценции не содержащих металла порфирина. То есть свечение набухающих семян обусловлено присутствием в них порфирина не содержащего метала.
Рис. 3. Уровень ФКТ семян фасоли (кружки), пшеницы (треугольники), гороха (ромбы) (1) и амплитуды Т2 сигнала ЯМР (2) при разном содержании воды в семенах.
Фосфоресценцию биополимеров наблюдают при криогенных температурах. При температуре выше 170 К фосфоресценция быстро снижается. Тушителем фосфоресценции является кислород [Гиллет, 1988]. Фосфоресценцию сухих семян при комнатной температуре можно наблюдать, потому что в них практически отсутствует кислород. При увлажнении семян диффузия кислорода в семя возрастает и фосфоресценция снижается. На рис. 3 кривой 1 показано, как с увеличением содержания влаги в семенах снижается ФКТ (коэффициент корреляции -0,96- -0,98). Увлажнение семян до 18-20% приводит к полному исчезновению ФКТ. При влажности семян 18-20%, судя по резкому в возрастанию амплитуды Т2 сигнала ЯМР, в семенах появляется свободная вода (рис. 3,кривая 2).
На основании зависимости ФКТ биопрепаратов и семян от влажности нами был предложен чувствительный метод оценки влажности этих объектов [Авт. свид. № 1047431, 1981]. Фосфоресцентным методом можно определить разницу в содержании воды до 0,1-0,2% при общей влажности от 6 до 20%. Другие инструментальные методы имеют близкую чувствительность, но при влажности объектов выше 30-40%.
Рис. 4. Соотношение между всхожестью семян сои (1), ржи (2) и пшеницы (3) и их уровнем ФКТ. Числами около верхней линии указана влажность семян сои соответствующей всхожести.
При хранении (старении) сухих семян разных видов параллельно со снижением всхожести возрастает уровень их ФКТ (рис. 4). Коэффициент корреляции между всхожестью и уровнем ФКТ составляет -0,94 - -0,98.
Поэтому, было предложено по уровню фосфоресценции семян судить о всхожести партии [Авт. свид. № 1131488, 1982].
Известно, что обезвоживание характерно для биополимеров и жизнедеятельных организмов при их старении [Воюцкий, 1960; Серами и др., 1987; Растинг, 1993]. В процессе старения семян и их гибели содержание них воды также снижается (числа около прямой 1 на рис. 4). Вода в воздушно-сухих семенах является, в основном, связанной [Аксенов, 2006]. А в процессе гибели содержание воды уменьшается на 1,5-2%, (т.е. теряется пятая часть связанной воды). Известно, что такая потеря воды отражает необратимые перестройки макромолекул, сопровождающиеся уменьшением их водоудерживающей способности [Библь, 1963; Levitt, 1972; Голдовский, 1986].
Распределение сухих семян по уровню ФКТ (фракции). Методом ФКТ можно проводить измерения без нарушения целостности семян, что дает возможность периодически контролировать их влажность в процессе хранения. Вследствие высокой чувствительности ФКТ метода можно регистрировать сигнал от отдельных семян и анализировать состав популяции. На рисунке 5 показаны распределения по уровню ФКТ семян из партий разной всхожести. Распределение семян гороха в партии с 98-%-ной всхожестью выглядит близким к нормальному. В партии со всхожестью 72% распределение имеет два максимума, а у семян с 50%-ной всхожестью - три. Тесная взаимосвязь между уровнем свечения и влажностью семян, позволила считать, что их распределение в партии по уровню ФКТ отражает распределение семян по влажности. Эта закономерность легла в основу анализа гетерогенности партии семян по влажности.
Рис. 5. Распределение семян гороха в партиях с разной всхожестью по уровню ФКТ. Римскими цифрами обозначены номера фракций.
Средняя влажность семян в партии 72%-ной всхожести - 9,52%. Однако определение влажности семян фракции I, отобранных из этой партии, как и влажность семян партии 98%-ной всхожести состав-ляла 9,84%. Влажность семян фракции II (уровень ФКТ 50-60 отн. ед.) - 8,90%, а фракции III, отобранной из партии 50%-ной всхожести (уровень 80-110 отн. ед.) - 8,2%. Т.е. в партиях семян пониженной всхожести семена могут значительно отличаться по содержанию воды, т.е. увеличивается гетерогенность семян в партии. Усреднение влажности партии семян 50%-ной всхожести по всем обнаруженным фракциям с учетом их долевого вклада дает значение среднее влажности при обычном определении у нефракционированной партии 9,2%.
Вид распределений по уровню ФКТ свидетельствовал о наличии в популяции семян трех фракций (субпопуляций, групп): I, II и III, как, например, показано на рис. 4 для партии семян с 50%-ной всхожестью. В каждой группе семена распределены нормально, семян с промежуточным уровнем ФКТ мало.
При проращивании из семян фракции I вырастали нормальные проростки. Из семян фракции II преимущественно выросли проростки с морфологическими дефектами, которые считаются ненормальными. Семена фракции III не прорастали, т.к., по-видимому, были мертвыми.
Таким образом, ранжируя воздушно-сухие семена по уровню ФКТ, можно выбрать семена, из которых вырастут проростки определенного качества. Отобрав ослабленные семена фракции II, можно было выяснить причину, по которой из этих семян вырастают проростки с морфологическими дефектами, и уменьшается всхожесть партии семян. Определив эту причину, можно было понять, каким образом стимулирующие воздействия ее устраняют.
III.1.2. Набухание семян бобовых
ФКТ воздушно-сухих семян уменьшалось до фона, когда в набухающем семени появлялась свободная вода. Однако, при дальнейшем увлажнении (при содержании воды в семени более 50%) у некоторых семян свечение возникало вновь, и могло в 5-10 раз превышать свечение семян в воздушно-сухом состоянии (рис. 6, кривая 3). Такие семена не прорастали (подвергались лизису).
Рис. 6. Фосфоресценция проклюнувшихся (1 и 2) и не проклюнувшегося (3) семян гороха во время набухания. Стрелкой показан момент проклевывания. Слева от пунктирной линии показано затухание ФКТ сухих семян при их увлажнении
О том, что есть для вида свечения свидетельствуют спектры. Спектр ФКТ сухих семян широкий. В спектре излучения набухших семян (рис. 2, кривая 2) присутствовали четыре характерных максимума. На этом основании и, учитывая спектр возбуждения свечения (рис.2, кривая 3), был сделан вывод, что свечение набухших семян является фосфоресценцией не содержащих металла порфиринов.
Когда зародышевый корешок у набухающего семени прорывал семенную оболочку (проклевывание семени), то свечение снижалось (кривые 1 и 2). Если уровень свечение был низкий, то вырастал нормальный проросток. При среднем уровне свечения семя проклевывалось, свечение падало, но из такого семени чаще всего вырастал проросток с морфологическими дефектами.
Известно, что наблюдать фосфоресценцию порфиринов можно лишь при очень низком содержании кислорода в среде (меньше 20 мкМ) [Теренин, 1967]. Это означает, что у набухающих семян светятся только те структуры, где содержание кислорода меньше 20 мкМ. Свечение набухших семян исчезало после нарушения целостности семенной оболочки. У “потухших” на воздухе семян свечение частично восстанавливалось в атмосфере азота или при помещении семян в раствор Na2SO3 (с целью удаления из воды кислорода), что доказывает дефицит кислорода под оболочкой семени [Веселова и др., 1985в; Veselova et al., 1988]. Как нами было показано, оболочка плохо проницаема для кислорода, а кислород активно поглощается зародышем набухающего семени в процессе дыхания [Веселова и др., 2003]. При содержании воды в семенах гороха 45-50% завершается митохондриогенез [Obroucheva, 1999]. Как показано на рис. 7, снижение концентрации кислорода в герметичной камере при митохондриальном дыхании зародышевых осей семян гороха приводит к пропорциональному возрастанию фосфоресценции порфиринов. Блокирование митохондриального дыхания цианидом замедляло поглощение кислорода и нарастание фосфоресценции порфиринов [Веселова и др., 1985в].
Таким образом, уровень фосфоресценции эндогенных порфиринов у набухших семян может служить маркером степени недостатка кислорода под оболочкой.
Рис. 7. Соотношение между концентраций кислорода в камере и уровнем фосфоресценции порфиринов зародышевых осей семян гороха.
III.1.3. ТЕРМОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД НАБЛЮДЕНИЯ АМИНО-КАРБОНИЛЬНОЙ РЕАКЦИИ В ПОРОШКАХ СЕМЯН
Известно, что при хранении в семенах повреждения белков и нуклеиновых кислот вызывают продукты автоокисления мембранных липидов и процесс неферментативного гликозилирования восстанавливающими сахарами (амино-карбонильная реакция) [Smith, Berjak, 1995; Sun, Leopold, 1995]. Исследование роли этих процессов в снижении качества семян затрудняет определение их продуктов, имеющих сходные спектральные характеристики и присутствие в семенах флуоресцирующих соединений полифенольной природы [Feeney, Whitaker, 1982; Ory, St.Angelo, 1982; Baker, Bradford, 1994]. Известно, что хемилюминесценция возникает при автоокислении липидов [Тарусов, Журавлев, 1965] и гликозилировании белков [Castilho et al., 1994]. Обычно ее регистрируют при повышенной температуре. Так, например, термохемилюминесценцию листьев гороха и водорослей в красной области спектра (>650 нм), обусловленную терми-ческих распадом перекисей липидов, наблюдали ранее [Венедиктов и др. 1989; Stallaert et al., 1995].
Для определения продуктов перекисного окисления липидов и неферментативного гликозилирования белков в сухих семенах мы регистрировали температурные зависимости хемилюминесценции порошков семян (в сине-зеленой части спектра, максимум при 450 нм). В модельных опытах наблюдали ТХЛ в порошках аминокислот и белков с разными восстанавливающими сахарами, линоленовой кислотой (18:3) и глютаровым диальдегидом. Температуру объектов от комнатной до 190-200ОС повышали со скоростью 10О/мин.
Рис. 8. Термограмма хемилюминесценции порошка семян огурцов без добавок (1), и с добавлением 0,5% раствора глютарового диальдегида (2) и 2,5% порошка глюкозы (3).
Термограмма порошка семян представляет экспоненциально нарастающую кривую, начиная от 110ОС (рис. 8-А, кр. 1). ТХЛ смеси порошка семян с глюкозой свидетельствует о том, что при температуре выше 130ОС свечение обусловлено участием в хемилюминесцентной реакции глюкозы (максимум при 150ОС, кривая 3).
В области температур от 50 до 110ОС в ТХЛ, по-видимому, участвуют продук-ты перекисного окисления липидов, как показывает термограмма порошка семян при добавлении глютарового диальдегида (кривая 2).
Свечение порошка из мертвых семян при этих температурах в несколько раз превышало фон. После обработки порошка хлороформ-метанольной смесью свечение пропадало.
Иммобилизованная на кварцевом песке линоленовая кислота (18:3), имела низкий уровень ТХЛ (рис. 9, кривые 1, 2). В присутствии порошка триптофана
Рис. 9. ТХЛ не окисленной (1, 3) и окисленной (2, 4) линоленовой кислоты, иммобилизованной на кварцевом песке (1, 2) и порошке триптофана (3, 4).
ТХЛ окисленной кислоты многократно возрастала (кривая 4). Т.е. для возникновения ТХЛ в этой химической системе необходимо наличие аминогруппы. 0,5%-ный раствор глютарового диальдегида активировал хемилюминесценцию различных аминокислот и коллагена (данные не приведены). ТХЛ при 90ОС использовали как свидетельство присутствия в семенах продуктов перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот.
В модельных опытах наблюдали ТХЛ в смеси глюкозы с различными аминокислотами и растительными белками. Эти вещества в отдельности не обладали ТХЛ. Термограммы смеси аминокислот и белков с глюкозой в координатах Аррениуса имели такой же наклон (энергию активации), что и термограмма порошка семян. Это позволило предположить, что свечение семян при высокой температуре обусловлено реакцией гликозилирования.
Рис. 10. Зависимость стимуляции уровня ТХЛ при 150ОС от количества глюкозы, добавленной к порошку семян гороха (черные ромбы).
Пропорционально увеличению количества экзогенной глюкозы в порошке семян (от 0,2 до 5 мг/г) возрастал уровень ТХЛ при 150ОС (рис. 10). На основании этой зависимости можно показать, что количество эндогенной глюкозы в порошке семян гороха не превышает 0,1 мг/г семян. Подобное же значение (0,08-0,11 мг/г) содержания глюкозы в семенах гороха и сои приводятся в литературе [Locher, Bucheli, 1998].
На основании этих результатов уровень ТХЛ порошка сухих семян при 150ОС мы использовали как показатель содержания в них глюкозы.
III.2. ДИНАМИКА КАЧЕСТВА СЕМЯН ПРИ РАЗНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ
Поскольку нами был разработан метод оценки индивидуального качества семян, представляло интерес проверить, можно ли анализируя распределение воздушно-сухих семян по уровню ФКТ прогнозировать их качество в зависимости от дозы воздействия. В качестве действующих факторов были выбраны ?-облучение и влаготепловая обработка семян (40ОС и 85% относительная влажность воздуха). Проникающая радиация, как и тепловая обработка, ускоряют старение семян [Roberts, 1972].
Рис. 11. Всхожесть семян гороха (1) и средний уровень ФКТ (2) через неделю после облучения.
III.2.1. Изменение ФКТ воздушно-сухих семян гороха и их всхожести под влиянием облучения. С увеличением дозы облучения всхожесть семян гороха и средний уровень ФКТ воздушно сухих семян до проращивания изменялись сложным образом. При малых дозах 190 мГр и 3 Гр всхожесть уменьшалась до 58 и 45%, соответственно (рис. 11, кривая 1), а уровень ФКТ возрастал (кривая 2). Всхожесть семян, облученных в дозах 7 и 10 Гр, была близка к исходной. Уровень ФКТ соответствовал свечению необлученных семян. После больших доз облучения всхожесть падала и при 100 Гр составляла 4%. ФКТ возрастало и превышало исходный уровень почти втрое у семян, облученных в дозе 100 Гр.