Материал: Фарм производство БАР

Затем культуральная жидкость фильтруется для удаления мицелия. С этой целью пользуются фильтр-прессами, обеспечивающими высокую скорость фильтрации. До подачи жидкости в фильтр к ней для улучшения фильтрации примешивают наполнитель, не поглощающий стрептомицин. После такой первичной фильтрации рН фильтрата доводят до определенной величины, а затем окончательно отфильтровывают его с помощью второго фильтра. Осадок, оставшийся после фильтрации, утилизируется.

Стрептомицин и некоторые примеси извлекают из фильтрата путем адсорбции на активированном угле, который затем автоматически подается в фильтр-пресс, где остатки неактивной жидкости отделяются. Стрептомицин смывается с активированного угля разбавленным спиртовым раствором соляной кислоты, нейтрализуется и затем концентрируется путем упаривания. Полученный концентрат обрабатывается ацетоном, который осаждает солянокислый стрептомицин. Смесь фильтруется через пресс, причем фильтрат поступает на регенерацию растворителя. К безводному спиртовому раствору соли стрептомицина добавляют спиртовой раствор хлористого кальция, чтобы получить кристаллическую соль стрептомицина. В асептических условиях соль стрептомицина растворяют в воде, пропускают через фильтр (0,22 мкм) для стерилизующей фильтрации с целью удаления микроорганизмов, затем подвергают лиофилизации, измельчают в порошок и фасуют.

2.6.3. Получение гентамицина

Гентамицина сульфат – антибиотик, относящийся к группе аминогликозидов; представляет собой смесь гентамицинов сульфатов, которые образуются культурой Micromonospora purpurea. Основные компоненты гентамицина сульфата представлены как:

С1 (С21Н43N5O7), где R1 – СН3, R2 – СН3, R3 – Н;

С1а (С19Н39N5O7), где R1 – Н, R2 – Н, R3 – Н;

С2 (С20Н41N5O7), где R1 – Н, R2 – СН3, R3 – Н;

С2а (С20Н41N5O7), где R1 – Н, R2 – Н, R3 – СН3; С2b (С20Н41N5O7), где R1 – СН3, R2 – Н, R3 – Н.

68

В соответствии с требованиями фармакопеи проводят нормирование каждого компонента: С1 – от 20 % до 40 %; С1а – от 10 % до 30 %;

С2, С2а, С2b – от 40 % до 60 %.

Гентамицин подавляет развитие грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе Proteus, Pseudomonas, не оказывает действия на грибы. Применяют гентамицин сульфат при различных инфекционных заболеваниях, вызванных чувствительными к нему микроорганизмами. Препарат особенно эффективен при инфекциях мочевыводящих путей, респираторных и желудочно-кишечных болезнях. В связи с широким спектром действия гентамицин назначают часто при смешанной инфекции, а также когда возбудитель не установлен (в том числе, при общей экстренной профилактике).

Субстанция гентамицина сульфата представляет собой пористую массу или порошок белого или почти белого цвета. Гигроскопичен, легко растворим в воде, практически не растворим в 95 %-ном спирте, хлороформе, эфире.

Современное промышленное получение гентамицина сульфата – это сложная многоступенчатая система, состоящая из ряда последовательных технологических стадий. На рис. 12 представлена технологическая схема получения гентамицина сульфата.

69

Приготовление посевного материала на агаризированной питательной среде

Выращивание вегетативного посевного материала в колбах

Выращивание посевного мицелия в биореакторах

Биосинтез гентамицина (культивирование)

Предварительная обработка и ультрафильтрация культуральной жидкости гентамицина

Сорбция гентамицина на катионите КБ-2 в аммонийной форме и десорбция

Получение концентрата гентамицина

Получение осветленного концентрата гентамицина и перевод его в сульфатную форму

Распылительная сушка водных растворов гентамицина

Фасовка, упаковка и маркировка

Контроль

Рисунок 12 – Технологическая схема получения гентамицина сульфата

70

Приготовление посевного материала. Исходной в производстве гентамицина является культура Micromonospora purpurea var. Violacca

штамм ВНИИ-7R, выращенная в пробирках на скошенной агаризированной среде Гаузе-1.

Подготовка посевного материала – одна из ответственных операций в цикле биотехнологических процессов получения гентамицина. От ко-

личества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментере, так и биосинтез гентамицина в целом.

При получении вегетативного посевного материала второй генерации используют вегетативный посевной материал первой генерации, если он отвечает следующим требованиям:

биомасса средней густоты от бежевого до розово-сиреневого цвета, при взбалтывании мицелий обволакивает стенки флакона, не оседает на дно и не расслаивается;

при микроскопии окрашенного препарата наблюдаются микроколонии, гифы длинные или средней длины, волнистые, протоплазма базофильная, иногда в виде пунктира;

посторонняя микрофлора отсутствует.

Выращивание вегетативного посевного материала второй генерации осуществляют в посевном биореакторе для глубинного культивирования, снабженного мешалкой, барбатером для подачи воздуха, рубашкой для нагрева и охлаждения среды. Приготовление посевной среды проводят в биореакторе БИОР-0,1.

Биосинтез гентамицина (культивирование). Процесс биосинтеза гентамицина в аппаратах БИОР-0,25 осуществляется методом периодического глубинного культивирования. Посевной материал вносят в среду для культивирования в количестве 5–10 % от её объема. Культивирование длится 6–7 суток. В табл. 4 показаны режимы культивирования продуцента гентамицина в биореакторе БИОР-0,25.

71

Таблица 4 – Режимы культивирования продуцента гентамицина в биореакторе БИОР-0,25

Изменение режимов аэрации в ферментере проводят с учетом массообменных характеристик аппаратов по сульфитному числу. Давление в процессе биосинтеза поддерживается в пределе 0,05–0,2 кгс/см2. При вспенивании культуральной жидкости вводят порционно 50 см3 стерильного пенногасителя.

Предварительная обработка и ультрафильтрация культуральной жидкости. Культуральную жидкость из ферментера загружают в приемную емкость, включают насос на перемешивание и проводят предварительную обработку последовательным добавлением реагентов (растворы щавелевой кислоты, цетилперидиний бромида) для коагуляции белков и удаления поливалентных металлов.

Процесс ультрафильтрации осуществляют на установке типа УСФ-1. При ультрафильтрации культуральной жидкости происходит процесс концентрации растворов высокомолекулярных соединений (в том числе и антибиотиков) с одновременной очисткой их от низкомолекулярных примесей путем пропускания раствора через мембрану.

Сорбция гентамицина на катионите КБ-2 в аммонийной форме и десорбция. Процесс выделения и химической очистки гентамицина на катионите КБ-2 включает следующие операции: сорбция гентамицина из нативного раствора, элюирование минорных компонентов, десорбция гентамицина.

72

Для сорбции гентамицина его нативный раствор из сборной емкости подают насосом снизу вверх на ионно-обменную колонку, заполненную катионитом КБ-2 в аммонийной форме.

В колонне десорбции проводят стадию химической очистки (удаление гентамициноподобных и окрашивающих примесей) и десорбцию гентамицина.

Элюирование минорных компонентов примесей проводят 0,043Н раствором аммиака, пропуская его через слой катионита в ионообменной колонне сверху вниз:

[R(СОО)5 – гентамицин-комплекс с минорными примесями] + 5NН4ОН => [R(СОО)5 – гентамицин-комплекс без минорных примесей] + [гентамициноподобные минорные примеси]5.

Десорбцию гентамицина проводят 5 %-ным раствором аммиака, пропуская его через колонну с катионитом сверху вниз.

Получение концентрата гентамицина. Полученный элюат гентами-

цина упаривают на роторном испарителе (Т = 50–55 °С, Р = 0,085 МПа) для удаления аммиака и концентрирования гентамицина до

60000–70000 мкг/см3.

Осветление концентрата гентамицина основания углем и перевод его в сульфат форму. Очищенный и сконцентрированный раствор гентамицина основания помещают в колбу и подкисляют раствор 20 %-ной серной кислоты до рН 6,0–6,5; добавляют активированный уголь (7 % от объема концентрата) и нагревают до 40–45 °С при перемешивании 30 мин, затем уголь отфильтровывают.

Распылительная сушка водных растворов гентамицина сульфата.

Распылительную сушку осветленного концентрата гентамицина сульфата производят на лабораторной сушилке типа УРС-0,5, предназначенной для распылительного обезвоживания растворов в асептических условиях. Осушителем является очищенный воздух.

Перед началом работы все детали сушильной камеры моют, протирают спиртом, собирают и высушивают горячим воздухом при 108 °С.

Далее устанавливают значения температур воздуха-теплоносителя: на входе в сушильную камеру – 175–185 °С; на выходе из сушильной камеры – 103–105 °С.

73

Раствор антибиотика, подаваемый в сушильную камеру, распыляется в токе нагретого воздуха до мелких капель.

Фасовка, упаковка и маркировка препарата гентамицина сульфа-

та. Загрузку и выгрузку препарата из сушилок, а также фасовку проводят в помещениях, где поддерживаются асептические условия.

Фасовка осуществляется в ламинарном боксе. Порошок гентамицина сульфата переносят из приемной тары распылительной сушки в банки из оранжевого стекла с винтовой горловиной и навинчиваемой крышкой.

2.7. Контроль антибиотиков

Требования к качеству антибиотиков изложены в Государственной Фармакопее Украины и Европейской фармакопеи. Методов определения активности антибиотиков много, но главным из них является микробиологический.

Способность убивать или тормозить рост и развитие микроорганизмов называют биологической активностью препарата. В связи с этим различают цидное и статическое действия веществ. Например, антибиотики обладают фунгицидным, бактерицидным действием или фунгистатическим и бактериостатическим действием.

Для количественного определения активности антибиотика введено понятие единицы действия (ЕД). При определении активности выделенного антибиотика обычно в качестве эталона используют химически чистый препарат с заранее известной величиной активности. ЕД – это активность определенного весового количества антибиотика, принятого за эталон.

Активность антибиотиков определяют путем сравнения степени угнетения роста чувствительных микроорганизмов в результате действия испытуемого антибиотика и стандартного образца в известных концентрациях. Стандартные образцы, используемые для количественного определения, представляют собой вещества, активность которых точно установлена в соответствие с международным стандартом препарата. При количественном определении активности доверительные интервалы (Р = 0,05) должны составлять не менее 95 % и не более 105 % от установленной активности.

Количественное определение проводят, используя один из двух ме-

тодов: метод диффузии или турбометрический метод.

74

Метод диффузии. Питательную среду, рекомендованную для количественного определения, расплавляют и вносят в нее при температуре, например, от 48 °С до 50 °С определенное количество суспензии микроорганизмов, чувствительных к исследуемому антибиотику. После внесения тест-микроорганизма, питательную среду разливают в чашки Петри (слой от 2 мм до 5 мм). Затем готовят растворы стандартного образца с известными концентрациями и растворы исследуемого антибиотика в концентрациях аналогичных концентрациям стандартного образца. Растворы вносят в лунки на твердой среде, содержащей тест-микроорганизмы. Чашки инкубируют при подходящей температуре около 18 часов. Затем измеряют диаметры круглых зон угнетения роста с точностью не менее 0,1 мм (или их площадь) и рассчитывают активность, используя подходящие статистические методы.

Турбометрический метод. В питательную среду вносят суспензию микроорганизмов, чувствительность которых к испытуемому антибиотику обеспечивает достаточно сильное угнетение роста в условиях проведения эксперимента. Затем готовят растворы стандартного образца с известными концентрациями и растворы исследуемого антибиотика в концентрациях аналогичных концентрациям стандартного образца. Равные объемы каждого из растворов вносят в одинаковые пробирки и добавляют в каждую пробирку равные объемы инокулированной питательной среды. Пробирки выдерживают при указанной температуре от 3 до 4 часов. После окончания периода инкубации останавливают рост микроорганизмов путем добавления в каждую из пробирок 0,5 мл формальдегида. Проводят измерение мутности и проводят расчет активности, используя подходящие статистические методы.

Кроме микробиологического метода контроля применяют химические и физико-химические методы: колориметрию, жидкостную и тонкослойную хроматографию, спектрофотометрию в ультрафиолетовой и инфракрасной областях и др.

В табл. 5 приведена характеристика субстанций антибиотиков в соответствии с требованиями фармакопеи Украины. Субстанция антибиотиков также проходит контроль по следующим тестам: стерильность, бакте-

75

риальные эндотоксины или пирогенность, тяжелые металлы, аномальная токсичность, оптическая плотность, компонентный состав и др.

Таблица 5 – Характеристика субстанций антибиотиков в соответствии с требованиями фармакопеи Украины

Продолжение таблицы 5

Заключение

Необходимость поисков новых антибиотиков обусловлена многими причинами. Так, ежегодно на нашей планете умирают от инфекционной патологии более 50 млн. человек. С инфекционными и паразитарными болезнями связаны 25 % смертности в мире, а с учетом роли инфекции в «неинфекционных» заболеваниях – почти 35 %. Кроме того, наблюдаются «возвращающиеся инфекции», т.е. инфекции, которые достались нам в наследство от предыдущих веков. Среди них туберкулез, малярия, лейшманиоз, инфекции, передающиеся половым путем (например, сифилис). В то же время, наблюдается появление новых инфекций.

Наряду с этим выявлены и недостатки, связанные с высокой резистентностью микроорганизмов к антибиотикам и появлению штаммов не только антибиотикоустойчивых, но и антибиотикозависимых.

Кроме того, установлено, что широкое и бесконтрольное применение антибиотиков быстро привело к появлению резистентных и атипичных форм

77