без последующего диализа при температуре 2–4 °С и рН 6,9–7,0. К образовавшейся пастообразной массе добавляют в качестве стабилизатора глюконат кальция (9,0 %). Если защитным покрытием служит пектин, его добавляют одновременно с глюконатом кальция в количестве 3,0 % от массы. Массу наносят на кассеты (слоем толщиной 1 см) и высушивают из замороженного состояния в лифилизаторах, обеспечивающих рабочее давление в сублимационной камере до 5·10-2 мм рт. ст. и позволяющих достичь величины остаточной влажности продукта 2–4 %. Высушенную массу размельчают с помощью специального гранулятора и контролируют на специфическую стерильность, обсемененность посторонней микрофлорой и литическую активность. С учетом литической активности различных компонентов составляют смесь для таблетирования поливалентного препарата и определяют массу таблетки (в пределах 0,11–0,25 г).
Контроль литической активности (специфическая активность) про-
водят по методу Аппельмана. Используют 8–10 пробирок с 4,5 мл питательной среды, например, мясопептонным бульоном (рН 6,8–7,2). В первую пробирку прибавляют 0,5 мл исследуемого препарата бактериофага, перемешивают и переносят 0,5 мл смеси во вторую пробирку. Процесс повторяют со следующими пробирками, получая в каждой пробирке разведение 1:10. В каждую пробирку прибавляют по 0,1 мл культуры соответствующих бактерий, выращенных в течение 18 часов и содержащей 109 в 1 мл взвеси. Пробирки тщательно перемешивают и помещают на 18–20 часов при температуре 37 ± 0,5 °С. Титр препарата бактериофага определяется по последней пробирке, в которой четко выраженный лизис.
Для определения специфической активности бактериофагов также
широко используется метод Грациа.
Сегодня препараты бактериофагов выпускаются в нескольких лекарственных формах: жидкий препарат для внутреннего применения, таблетки, суппозитории, кремы, гель-спреи и др. В сравнении с жидкой формой бактериофагов мягкая лекарственная форма имеет ряд преимуществ: значительно больший и более длительный контакт с местом поражения; бактериофаги начинают действовать сразу при нанесении и действует в течение длительного времени благодаря постепенному высвобождению; бактериофаги удобно использовать благодаря простоте нанесения на рану самим
288
пациентом; улучшение диффузии бактериофагов в кожу вследствие использования вспомогательных веществ.
Сегодня использование препаратов на основе бактериофагов переживает второе рождение, и они активно используются для профилактики и лечения бактериальных заболеваний, лечении гнойно-воспалительных заболеваний слизистой глаз и полости рта, профилактика гнойновоспалительных осложнений при ожогах, ранениях, операционных вмешательствах. Особо необходимо отметить, что беременные женщины, которых лечат бактериофагами, выздоравливают быстрее, новорожденные не страдают от инфекционных заболеваний и быстрее прибавляют в весе.
Бактериофаги нашли широкое применение для диагностики бактериальных заболеваний. Так, например, использование фаголизиса сибирскоязвенных бацилл специфическим сибирскоязвенным бактериофагом Гамма А-26 позволяет поставить предварительный диагноз в достаточно короткие сроки. Основное преимущество метода: простота, высокая специфичность, возможность проведения исследования в полевых условиях.
По мнению специалистов, фаготерапия в скором времени станет прорывом в борьбе с инфекциями и займет ту нишу, где не состоятельна современная иммунотерапия. В течение 5 лет производство бактериофагов станет одной из перспективных отраслей фармацевтической промышленности.
Всесторонние исследования, направленные на изучение бактериофагов, выполненные за последние 40–45 лет позволили широко использовать их для решения задач микробиологии, вирусологии, генетики, биохимии и биотехнологии.
289
Контрольные вопросы
1.Приведите систему классификации иммунобиологических препа-
ратов.
2.Какие основные требования предъявляют к живым бактериальным
ивирусным вакцинам?
3.Какую ценность представляют рекомбинантные бактерии для биотехнологического получения вакцин?
4.Дать характеристику вакцинам на основе пептидов и ДНК.
5.Какова роль адъювантов в вакцинах? Привести примеры использования адъювантов.
6.Каковы принципы конструирования полисахаридных вакцин?
7.Роль вакцинации в профилактике инфекционных заболеваний. Какие инфекции устранены благодаря вакцинации?
8.Описать классификацию цитокинов и определить их роль в организме человека.
9.Опишите технологическую схему получения лейкоцитарного интерферона.
10.Опишите технологическую схему получения рекомбинантного интерферона.
11.Укажите основные методы идентификации и контроля препаратов, содержащих интерфероны. Каким образом определяют антивирусную активность интерферона?
12.Опишите технологическую схему получения интерлейкина-2. Какие методы используются для очистки? Указать лекарственные формы препаратов.
13.Опишите технологическую схему получения интерлейкина-1 . Какие методы используются для очистки? Указать лекарственные формы препаратов.
14.Проведите анализ технологии получения гранулоцитного колониестимулирующего фактора и укажите методы межоперационного контроля. Роль данного фактора.
15.Какова роль факторов свертывания крови? Описать методы получения факторов свертываемости крови: VII, VIII и IX.
16.Какова роль фактора некроза опухоли? Описать методы получения фактора некроза опухоли.
17.Описать структуру фагов и преимущества их использования по сравнению с антибактериальными препаратами.
18.Какие технологии применяют для получения препаратов фага? Описать методы контроля активности препаратов, содержащих фаги.
290
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
За ХХ столетие средняя продолжительность жизни людей увеличилась примерно на 30 лет с одновременным достижением активного долголетия, что в немалой степени обусловлено лекарственными препаратами, полученными методами биотехнологии: вакцинами, интерферонами, моноклональными антителами, биологическими факторами и другими. Так, например, в настоящее время только вакцины предотвращают ежегодно до 3 млн. смертей. В настоящее время большинство государств рассматривают проведение вакцино-профилактики как наиболее эффективный, экономически оправданный и доступный способ снижения смертности взрослых и детей при борьбе с инфекционными заболеваниями.
Разработка лекарственных препаратов осуществляется мировыми лидерами биотехнологического производства на базе передовой техники и технологии в объединении с опытом и квалификацией ученых и специалистов. Сегодня препараты таких фирм как «GlaxoSmithKline Biologicals» (Бельгия), «Aventis Pasteur» (Франция), «Heber Biotec» (Куба), «LG Chemical Ltd» (Корея), «Solvay Pharmaceuticals» (Нидерланды), «Chiron Behring GmbH & Co» (Герамания) и многих других хорошо зарекомендовали себя на мировом рынке биотехнологических продуктов.
Что препятствует развитию фармацевтической биотехнологии в Украине сегодня? Скорее всего, главным препятствием является недопонимание и недооценка данного направления для нашей страны. Обращает на себя внимание тот факт, что в Украине ведущие фармацевтические предприятия производят биотехнологические препараты из экспортируемых активных фармацевтических ингредиентов (инсулины, витамины, вакцины in bulk, интерфероны и др.). В Украине на сегодняшний день практически отсутствует производство биотехнологической продукции по полному циклу. Исключением являются «ФармБиотек», «Биофарма», «Диапрофмед». Вакцины для применения в медицине производит только ЗАО «Биолек» (вакцины для профилактики дифтерии и столбняка). В то же время, в
291
Европейских странах биотехнология играет значительную роль (до 30 %) в |
разработкам около 1,24 млрд. дол. и заняли второе место по объему при- |
|
диагностике, производстве вакцин и лекарственных препаратов. Необхо- |
влечения средств после разработок по программному обеспечению. |
|
димо отметить, что Украина сегодня не имеет ни современной производ- |
В Украине 22 июня 2011 года была принята Правительственная про- |
|
ственной базы для выпуска продукции фармацевтической биотехнологии, |
грамма «О разработке новейших технологий и создании отечественных ле- |
|
ни научной школы по разработке оригинальных биотехнологических пре- |
карственных средств», рассчитанная на 2011–2015 г.г. Общая сумма, пред- |
|
паратов. |
полагаемая на эту программу 2,7 млрд. гривен, из них 1,2 млрд. гривен из |
|
Для примера можно привести данные о том, что с компанией |
государственного бюджета и только 300 млн. гривен выделяется на фун- |
|
«GlaxoSmithKline Biologicals» (Бельгия) работают 35 академических ин- |
даментальные исследования. Программой предусмотрено создание лекар- |
|
ститутов и ученые из разных стран. Бесспорно, разработка и производство |
ственных и диагностических препаратов на основе биотехнологических |
|
вакцин дело дорогостоящее и создание препаратов против всех инфекций |
процессов, а именно: новые диагностические препараты на основе ДНК- и |
|
не только невозможно, но и не целесообразно. Однако создание и совер- |
РНК-технологий; диагностические препараты на основе рекомбинантных |
|
шенствование вакцин против основных инфекций, входящих в Календарь |
белков и иммунных подходов; терапевтические препараты на основе ре- |
|
прививок – дело необходимое. Это позволит украинскому государству |
комбинантных белков, антител, ДНК- и РНК-технологий; лекарственные |
|
своевременно проводить вакцинацию населения качественными и эффек- |
препараты на основе клеточных технологий. Непонятно, каким образом, |
|
тивными вакцинными препаратами и уменьшить зависимость Украины от |
предполагается за такой короткий срок и за указанные выделенные сред- |
|
иностранных производителей. Доказательством этому служит ситуация, |
ства создать вышеперечисленные группы препаратов. Для сравнения, при- |
|
которая сложилась в 2011 году, когда своевременное проведение вакцина- |
водим данные зарубежных специалистов: для создания одного оригиналь- |
|
ции, в соответствии с Календарем прививок, было сорвано. Аналогичная |
ного биотехнологического терапевтического |
препарата необходимо |
ситуация сложилась и с факторами свертываемости крови, в том числе и |
10–15 лет и не менее 1 млрд. долларов. Нельзя не отметить, что по ряду |
|
для больных гемофилией. |
разработок Украина занимает ведущие позиции в исследованиях по созда- |
|
Развитие фармацевтической биотехнологии основано на современ- |
нию иммунобиологических препаратов на основе клеточных технологий. |
|
ных достижениях генной инженерии, микробиологии, иммунологии, раз- |
Так, например, в институте криобиологии и криомедицины АН и АМН |
|
витии производства биофармацевтического оборудования. Исход конку- |
Украины (г. Харьков) под руководством академика В.И. Грищенко были |
|
ренции в значительной степени будет зависеть от того, каким образом бу- |
проведены многолетние исследования, приведшие к разработке и про- |
|
дут использоваться новые знания в этой области. Причиной роста биотех- |
мышленной реализации двух оригинальных |
препаратов: «Платекс» |
нологической промышленности в ряде стран, выпускающей фармацевти- |
(2 формы) и «Криоцелл» (6 форм). Препараты получены из тканей, пла- |
|
ческую продукцию, является увеличение объема финансирования из госу- |
центы и кордовой крови человека в результате многостадийной техноло- |
|
дарственных и частных источников. В качестве примера, можно привести |
гии, и содержат биологически активные соединения белковой и пептидной |
|
данные о том, что по итогам II квартала 2011 года объем венчурного инве- |
природы тканей человека, замороженные при температуре до минус |
|
стирования в сфере биотехнологии увеличился на 46 % по сравнению с |
196 °С. Препараты используются в комплексе поддерживающей терапии в |
|
предыдущим годом. Причем, венчурные компании привлекли к данным |
качестве лечебно-профилактического иммуностимулирующего препарата |
|
292 |
293 |
|
при аллергических состояниях, при нарушении кровообразования, анемии, иммунопатологии, сосудистых и эндокринных патологиях, хронических воспалительных заболеваниях, патологии печени, ишемической болезни сердца, патологии беременности, сахарном диабете и его осложнениях, при хронических и подострых заболеваниях ЦНС. Сегодня в Украине это единственный пример регистрации препарата, полученного из тканей человека и прошедшего весь комплекс доклинических и клинических иссле-
дований. Вторым успешным направлением, получившим развитие в Укра-
ине, является нанобиотехнология, в частности, препараты, полученные на основе искусственных мембран – липосом. Сегодня, в Украине – единственной стране в СНГ, выпускаются липосомальные препараты различной направленности: «Липин», «Липодокс», «Лиолив», «Липофлавон». Данное направление признано приоритетным во многих странах мира с развитой фармацевтической наукой и промышленностью, являясь, по нашему мнению, единственным реальным примером применения нанотехнологий в фармации и медицине в Украине.
В настоящее время созданы вакцины против патогенов, вызывающих остротекущие инфекции. Для латентных и хронических заболеваний, вызываемых такими возбудителями как ВИЧ, герпес человека, вирус гепатита С, микобактерии туберкулеза и др. высокоэффективных вакцин еще не создано. Однако специалисты многих стран активно разрабатывают новые вакцины: пептидные, рекомбинантные, ДНК-вакцины и ряд других. Не останавливаются работы по совершенствованию традиционных вакцин.
Подтверждением этому может служить информация кубинских ученых, которые в 2008 году объявили о создании эффективной вакцины против гепатита С (в мире страдает от этой инфекции 200 млн. человек). Три генно-инженерных вакцины нашли широкое применение для массовых вакцинаций (гепатит В, боррелиоз, вирус бешенства). Только в США ежегодно производство вакцин увеличивается на 18 % (при общем росте фармацевтической промышленности около 4 %) и к 2011 году достигло
294
30 млрд. долларов. Сегодня на разных стадиях исследований находятся 20 вакцин только против ВИЧ-инфекции.
Важной группой биотехнологических препаратов являются моноклональные антитела, номенклатура которых увеличивается ежегодно. Моноклональные антитела открывают новый этап в химиотерапии различных заболеваний, так как позволяют осуществлять направленную биотерапию. Основные сферы применения: онкология, артриты, иммунные (включая иммуносупрессоры при трансплантации органов) и воспалительные процессы.
В среднем, после разработки идеи биотехнологического препарата на предклинические и клинические испытания уходит около 10 лет.
Учитывая направленность данной публикации, мы не могли остановиться на ряде препаратов, созданных и разрабатываемых в настоящее время: препаратах на основе растений; терапевтических вакцинах, направленных на лечение инсулинозависимого диабета, атеросклероза, инфаркта
идр.; лекарственных средств на основе компонентов дрожжевых клеток; биотехнологии аминокислот и др. Этим вопросам будет посвящена вторая часть публикации.
Сегодня на фармацевтическом рынке присутствуют сотни наименований биофармацевтических препаратов, в том числе и полученных при помощи генной инженерии: интерфероны и интерлейкины, вакцины и моноклональные антитела, витамины и гормоны, факторы некроза опухолей
исвертываемости крови, антибиотики, фаги и ряд других препаратов. Только простое перечисление биотехнологических фармацевтических продуктов, полученных с использованием различных методов, в том числе и генно-инженерных, может служить свидетельством успешности современной биотехнологии. Однако с другой стороны, несколько десятилетий работы в этом направлении, использовании десятков миллиардов долларов, участие известных ученых и институтов привели к появлению относительно «небольшого» количества препаратов. Как известно, из тех молекул, которые проходят скрининговые исследования, до доклинических исследо-
295
ваний доходит 0,1 % молекул, из которых только единицы выходят на клиническое изучение. Возникает закономерный вопрос. Почему? Постараемся ответить на этот вопрос.
Одной из причин, является тот факт, что эффекты препаратов, проявляющиеся in vitro и in vivo, могут не совпадать. В ряде случаев это обусловлено тем, что в целостном организме действует как изучаемое вещество, так и его метаболиты. В других случаях расхождение действия in vitro и in vivo обусловлены различиями в клеточных и молекулярных механизмах, приводящих к проявлению эффекта в целом организме и культуре клеток. В организме в ответ на действие препарата могут включаться дополнительные взаимосвязи и регуляторные механизмы, которые могут изменить эффект, вплоть до его реверсии.
Биотехнологическая революция является серьезным вызовом традиционным способам разработки лекарственных препаратов, требующим проведения адекватных и своевременных оценок, чтобы от указанных достижений можно было получить максимальную отдачу. В самом деле, успешная разработка биотехнологических лекарственных препаратов – это длительный процесс, которому многочисленные группы ученых и большое количество регуляторных организаций и производителей вынуждены посвящать годы.
Достижения XXI века в области создания лекарственных и диагностических препаратов на основе биотехнологии, основанные на научных достижениях, могут оказаться не менее впечатляющими, чем достижения XX века. У авторов данного учебного пособия существует надежда, что ВЫ – студенты и аспиранты НТУ «ХПИ», заинтересуетесь представленными материалами и внесете свой достойный вклад в развитие фармацевтической биотехнологии.
296
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Агеев Е.П. Мембранные процессы разделения. Критическая технология. Мембраны / Е.П. Агеев. – М., 2001.– С. 42–56.
2.Адамс М. Бактериофаги / М. Адамс. – М.: Иностранная литература, 1961.– 397 с.
3.Аладышева Ж.И. Основные принципы проведения валидации на фармацевтическом производстве / Ж.И. Аладышева, В.В. Береговых, А.П. Мешковский. – М., 2005.– 185 с.
4.Алексеев В.И. Прикладная молекулярная биология / В.И. Алексеев, В.А. Каминский. – М.: Комкнига, 2005.– 200 с.
5.Бейли Дж., Оллис Д. Основы биотехнологической инженерии.
В2-х частях / Дж. Бейли, Д. Оллис. – М.: Мир, 1989.– 562 с.
6.Белозерський В.И. Экспериментальные подходы к созданию энтеральных форм противодифтерийных препаратов / В.И. Белозерський, Е.М. Бабич, Ю.М. Краснопольский. – Анналы Мечниковского Института, 2006, № 4.– С. 9–13.
7.Береговых В.В. Нормирование фармацевтического производства / В.В. Береговых, А.П. Мешковский. – М., 2001.– 527 с.
8.Брок Т. Мембранная фильтрация / Т. Брок. – М.: Мир, 1987.–
464 с.
9.Виестур У.З. Биотехнология, биотехнологические агенты, технология, аппаратура / У.З. Виестур, И.А. Шмите, А.В. Жилевич. – Рига, Знание, 1987.– 253 с.
10.Волкова Н.А. Изучение факторов, влияющих на эффективность создания соматических трансгенных сельскохозяйственных животных – продуцентов рекомбинантных белков человека с молоком / Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст. – Биотехнология, 2006, № 4.– С. 36–44.
11.Воронин Е.С. Биотехнология / Е.С. Воронин. – С-Петербург, Гиорд, 2008.– 703 с.
12.Гавриков А.В. Зависимость процедуры выделения и очистки рекомбинантного интерферона-α-2b человека от условий его накопления в клетках штамма-продуцента в ходе регулируемого культивирования / А.В. Гавриков, И.А. Рязанов, В.Е. Калужский. – Биотехнология, 2006, № 5.– С. 23–31.
297