промывают 10 мМ натрий фосфатным буфером, рН 8,0, содержащим 1 М NaCl. ФНО элюируют со стеклянных шариков 20 %-ным этиленгликолем в 10 мМ натрий фосфатного буфера, рН 8,0, содержащим 1 М NaCl.
3. Элюат со стадии 2 наносят на колонку (2,5 х 20 см) с ДЕАЕ целлюлозой 53, уравновешенную 10 мМ натрий фосфатным буфером, рН 8,0, содержащим 0,01 % Твин 20, при скорости потока приблизительно 500 мл/час. После того как скорость потока установится 100 мл/час, вносят 4,2 х 106 единиц ФНО в образце 1000 мл при 4 °С. Колонку промывают указанным буфером и элюируют при возрастающем градиенте от 75, 150 и 500 мМ NaCl в 10 мМ фосфатном буфере, рН 8,0. Элюат контролируют по поглощению при 280 нм и по активности ФНО.
4.Полученный на 3-ей стадии элюат концентрируют и диализуют на мембране, пропускающей молекулярные массы меньше, чем у ФНО. Полученный концентрат ФНО помещают в колонку (5 х 0,5 см), заполненную сефарозой замещенной четвертичными аммониевыми группами. Промывают колонку буфером А (20 мМ Трис-HCl, pH-8,0, 0,01% Твин 20), а затем элюируют при линейном градиенте 40–75 мМ NaCl в буфере А. Элюент собирают в виде фракций по 2 мл и контролируют по поглощению при 280 нм и активность фактора некроза опухоли.
5.Полученные на стадии 4 фракции, содержащие ФНО, подвергают дальнейшей очистке рядом методов, определяемых исследователем:
хроматофокусирование (изоэлектрическая точка ФНО находится при 5,3);
препаративным электрофорезом на SDS-полиакриламидном геле (приблизительно 80 % активности ФНО инактивируется на этой стадии) – применяют для аналитического изучения;
высокоэффективная жидкостная хроматография позволяет выделить гомогенный ФНО с сохраненной биологической активностью.
Разработаны также способы получения рекомбинантных препаратов:
ФНО -тимозина и ФНО , используемых как для экспериментальных работ, так и для применения в клинике.
268
Рассмотрим технологическую схему выделения и очистки реком-
бинантного ФНО -тимозин. Для получения гибридного белка ФНО используют плазмидную ДНК pThy230, кодирующую данный белок. Гибридный белок ФНО получают культивированием штамма E. Coli SG20050
сплазмидой pThy230.
1.Выращивают штамм E. Coli SG20050 в 5 мл LB-среды при 37 °С в течение ночи. Разводят культуру свежим LB-средой в 50–100 раз и растят на качалке при 37 °С до оптической плотности при 590 нм равной 0,2–0,3. Если оптическая плотность более 0,3 культуру разводят LB-средой до 0,1 и подращивают 30 мин. Переносят 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждают клетки при 4 °С 5000g в течение 10 минут. НЖ удаляют, клетки суспендируют в 50 мл 0,1 М CaCl2 охлажденного на льду. Инкубируют клетки 20 минут на льду и их осаждают центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 10 мин при температуре 4 °С. НЖ удаляют, клетки суспендируют в 3 мл 0,1 М CaCl2, охлажденного на льду. К компетентным клеткам прибавляют стерильный глицерин до 15 % и хранят клетки для трансформации до трех месяцев при минус 70 °С. Переносят 3 мл клеток в охлажденную пробирку и добавляют 5–10 мкг плазмидной ДНК pThy230. Инкубируют на льду 1 час, а затем пробирку инкубируют при 42 °С в течение 5 минут. Переносят клетки в колбу с 100 мл нагретого до 37 °С L-бульона без антибиотика и инкубируют при 37 °С в течение 60–90 минут. Заполняют ферментер вместимостью 10 л 7 литрами L-бульона с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл. Нагревают среду в ферментере до температуры 30–34 °С и вносят посевную дозу 100 мл L-бульонной культуры свежеполученных трансформантов. Культивируют при температуре 30–34 °С и перемешивании (250–300 об/мин) с аэрацией воздуха 0,5 л/мин на один литр бульона. При достижении стационарной фазы роста, берут пробу для определения уровня синтеза гибридного белка методом электрофореза в 15 % в полиакриламидном геле с додецилсульфатом (ПААГ-ДСН). Клетки отделяют центрифугированием или микрофильтрацией, а затем используют для выделения гибридного белка. Экспериментально определено, что культивирование штамма E. Coli SG20050 (pThy230) при 30–34 °С приводит к образованию 100 % гибридного белка в растворимой форме.
269
2. Выделение и очистка T-ФНО. Клетки штамма E. Coli SG20050 с
плазмидой pThy230, выращенные при 30–34 °С, осаждают центрифугированием при 6000 об/мин 4 °С в течение 10 минут. Среду удаляют, клетки суспендируют в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ ЭДТА и 1мМ феноксиметилсульфонилфторида (ФМСФ), из расчета 10 мл буфера на 1 г клеток. Клетки разрушают пригодным способом, например, замораживанием – оттаиванием; ультразвуком трижды по 40 сек при 22 кГц; продавливанием через фильеру в French-прессе. Полученный лизат центрифугируют 10 мин при температуре 4 °С, и 5000g. НЖ отделяют от осадка и доводят CH3COOH до рН 5,8. Добавляют (NH)2SO4 до 28 % насыщения. Инкубируют 30 минут при комнатной температуре, центрифугируют 8000 g в течение 10 мин. НЖ наносят на колонку с фе- нил-сефарозой, уравновешенной 25 мМ натрий ацетатным буфером, содержащим 33 % (NH)2SO4, рН 5,6–5,8 (на 30 мл носителя около 100 мл лизата). Промывают колонку после нанесения белка 25 мМ натрийацетатным буфером, рН 5,8 (без (NH)2SO4), а затем элюируют белок 7 М раствором мочевины в том же буфере. Фракции, содержащие гибридный белок, наносят на колонку с носителем ДЕАЕ, уравновешенным 25 мМ натрий-ацетатным буфером рН 5,8 с 7 М мочевиной. Загрузка на 100 мл носителя около 100 мл белка. Промывают колонку 25 мМ натрийацетатным буфером рН 5,8 с 7 М мочевиной и 150 мМ NaCl. Фракции с гибридным белком наносят на колонку с голубой агарозой, уравновешенной 25 мМ натрий-ацетатным буфером рН 5,8 с 7 М мочевиной и 0,4 М NaCl. К образцу белка, фракции с ДЭАЕ, добавляют 1/100 объема 100 мМ ФМСФ и NaCl до 0,4 М. Наносят белок объемом до 200 мл на 30 мл носителя. Элюируют белок 50 мМ натрий-фосфатным буфером рН 7,8 с 7 М мочевиной и 400 мМ NaCl. Фракции, содержащие гибридный белок диализуют при 4–8 °С в течение 18 часов против 100 объемов буфера (150 мМ NaCl, 10 мМ натрия фосфата, рН 7,2–7,4). Заменяют буфер и диализуют еще несколько часов. Белок хранят при минус 20 °С.
Контроль биологической активности ФНО -тимозина проводят в тесте цитотоксичности на линии клеток фибросаркомы мыши L-929.
Клетки L-929 выращивают на среде RPMI 1640 с добавлением сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, 2мМ L-глютамина и 50 мкг/мл
270
гентамицина. Клетки помещают в лунки планшета и проводят инкубацию при 37 °С в атмосфере 5 % CO2 в течение ночи до образования монослоя. После инкубации удаляют среду и добавляют по 100 мкл свежей ростовой среды и двукратные разведения исследуемого ФНО -тимозина. В качестве контроля используют аттестованный стандарт ФНО -тимозина. Клетки инкубируют в течение 12 часов при тех же условиях. После инкубации среду удаляют и клетки окрашивают 0,5 % раствором генцианового фиолетового в течение 15 мин, после чего промывают водой и измеряют оптическую плотность. За единицу активности принимают разведение препарата, вызывающее 50 % гибель клеток, учитывая исходную концентрацию гибридного белка в препарате. Гибридный белок ФНО -тимозин обладает цитотоксической активностью 1–2·107 ед/мг белка. Исследованиями ФНО -тимозина в ПААГ-ДСН установлено: молекулярная масса 22 ± 1 кDа и чистота более 95 %. При гидролизе в 80%-ной муравьиной кислоте при 37 °С в течение 40–48 ч происходит расщепление ФНО - тимозина на два фрагмента: ФНО с молекулярной массой 17,5 ± 0,5 кDа и тимозин- 1 с молекулярной массой 3,1 ± 0,1 кDа.
Лекарственные препараты, содержащие тимозин- 1 является одним из немногих препаратов для лечения хронических вирусных гепатитов: для проведения монотерапии гепатита В и в составе комбинированной терапии с интерфероном для лечения хронического гепатита С.
Для получения рекомбинантного человеческого ФНО используют технологическую схему сходную со схемой получения ФНО , отличающуюся по ряду принципиальных положений.
В качестве штамма продуцента используют штамм E. Coli SG20050, трансформированный плазмидой pLT21, кодирующей ФНО под контролем двух промоторов ранней области бактериофага Т7.
Клетки штамма E. Coli SG20050 с плазмидой pLT21, выращенные при 30–34 °С, осаждают центрифугированием при 6000 об/мин 4 °С в течение 10 минут. Среду удаляют, клетки суспендируют в лизирующем буфере (А), содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 8,7–9,2, 1 мМ ЭДТА и 0,1мМ феноксиметилсульфонилфторида (ФМСФ), (5 мл буфера на 1 г клеток). Клетки разрушают ультразвуком. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием. НЖ подвергают очистке на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-52. Элюирова-
271
ние проводят линейным градиентом концентрации NaCl в буфере А. Фракции анализируют электрофорезом в 15 % в полиакриламидном геле. Фракции, содержащие рчФНО , объединяют. Обычно рчФНО элюируются с колонки при концентрации натрия хлорида 0,07–0,12 М. Объединенные фракции разбавляют в 2 раза буфером Б (10мМ КН2РО4, рН 7,0) доводят раствором HCl величину рН до 7,0 и наносят на колонку с гидроксилапатитом, уравновешенную буфером Б. После нанесения белкового раствора на колонку её промывают буфером Б до снижения оптической плотности раствора при длине волны 280 нм до оптической плотности буфера Б и белки элюируют линейным градиентом концентрации КН2РО4 от 0,01 до 0,3 М при рН 7,0. Обычно рчФНО элюируется при концентрации 0,15–0,2 М. Фракции, содержащие рчФНО объединяют и диализуют против буфера В (20 мМ HEPES, рН 6,6) в течение 20 часов и наносят на колонку с гидроксилапатитом, уравновешенную буфером В. Обычно рчФНО элюируется при концентрации 0,15–0,2 М. Фракции, содержащие рчФНО объединяют и диализуют против буфера Г (10 мМ NaH2PO4, рН 7,2, 0,15 М NaCl) Полученный препарат содержит 1,4 мг/мл (общий объем 73 мл), активность 3 · 107 ед/мг белка, электрофоретическая чистота не менее 95 %, содержание примесей ДНК – 32 пг/мл, ЛПС 200 нг/мг. Выход составляет 20 % от исходного гибридного белка.
Как прогормон ФНО существует в физиологических условиях в виде белка клеточной мембраны, экспрессируясь на поверхности макрофагов / моноцитов. При наступлении экстремальных условий, например, при вирусной инфекции или новообразованиях, под воздействием активирующих факторов транскрипция гена ФНО повышается в 3 раза, возрастает количество мРНК, вследствие чего увеличивается его количество. ФНО способен транскрибироваться в ответ на всевозможные стимуляторы (вирусы, энтеротоксины, эндотоксины и др.). Активный ФНО синтезируется, как правило, в течение 2 часов, далее вне зависимости от уровня антигенной стимуляции наблюдается прекращение транскрипции.
В настоящее время на фармацевтическом рынке присутствует несколько препаратов, в которых в качестве активного фармацевтического ингредиента присутствует ФНО -тимозин. Одним из таких препаратов является «Рефнот», производства российской фирмы «Фармаклон». «Реф-
272
нот» обладает прямым противоопухолевым действием in vitro и in vivo на различные линии опухолевых клеток. Препарат представляет собой генноинженерный слитый белок на основе фактора некроза опухоли α и тимозина α1 и рекомендован при раке молочной железы. Причем, токсичность препарата в 100 раз меньше, чем токсичность природного ФНО. Механизм действия ФНО -тимозин можно представить как:
непосредственное воздействие белка ФНО -тимозин на опухолевую клетку;
мишень через соответствующие рецепторы на её поверхности, в результате чего происходит апоптоз клетки (цитотоксическое действие) или прекращение клеточного цикла (цитостатическое действие);
каскад химических реакций, включающий активацию коагуляционной системы крови и местных воспалительных реакций, обусловленных активированным действием препарата клетками эндотелия и лимфоцитами, ведущее к «геморрагическому» некрозу опухоли;
блокирование ангигенеза приводящее к уменьшению прорастания новыми сосудами быстрорастущей опухоли и как следствие снижения кровоснабжения, вплоть до некроза опухоли;
воздействие клеток иммунной системы, цитотоксичность которых
оказалась тесно связанной с наличием молекул ФНО -тимозин. Установлено, что комбинация ФНО -тимозин (препарат «Рефнот») с
рекомбинантными - и -интерферонами обладает синергенным цитотоксическим эффектом. Препарат «Рефнот» усиливает противовирусную активность рекомбинантного -интерферона в 100–1000 раз против вирусного везикулярного стоматита.
Известен препарат «Альноран», представляющий собой человеческий рекомбинантный ФНО- , применяемый в комплексной терапии у взрослых при солидных опухолях различной локализации: злокачественных заболеваниях кожи, саркома Капоши, опухолях молочной железы, рака головы и шеи, меланомы и др. Кроме того, «Альноран» усиливает действие цитотоксических противоопухолевых препаратов при комбинированной терапии. Препарат «Бефнорин», представляющий собой человеческий рекомбинантный ФНО , идентичный природному ФНО с 22 по 171
273
аминокислоте с добавлением метионина на N конце, обладающий иммуностимулирующим, противоопухолевым и антиметастатическим действием.
Нельзя не остановиться еще на одном вопросе. При ряде заболеваний и патологических состояний наблюдается увеличение количества ФНО, что приводит к активизации патологических процессов и затруднению лечения. К таким заболеваниям относятся: ревматоидный артрит, туберкулез, болезнь Альцгеймера и другие заболевания ЦНС, грибковые инфекции и др. В этих случаях необходимо проводит нейтрализацию ФНО. Основными ингибиторами ФНО в настоящее время являются инфликсимаб, адалимумаб, этанерецепт, представляющие собой рекомбинантные препараты моноклональных антител (материалы о моноклональных антителах изложены в учебном пособии: Краснопольский Ю.М., Борщевская М.И. «Фармацевтическая биотехнология: Технология производства иммунобиологических препаратов». Харьков, НТУ «ХПИ», 2009 г.). Являясь антицитокинами, каждый из этих антител в значительной степени нейтрализует ФНО и тем самым существенно тормозит ряд патологических процессов.
Необходимо отметить, что в настоящее время, ФНО -тимозин (TNF ), ФНО (TNF ) и рецепторы факторам некроза опухоли: Fas
(CD95), FasL, TRAIL, CD40L, CD27L, CD30L (L- лиганд) и другие отно-
сятся к семейству фактора некроза опухоли.
Исследования по изучению структуры и свойств представителей данного семейства развиваются достаточно интенсивно и приводят к появлению оригинальных диагностических и лекарственных продуктов.
6.4. Антитромботические препараты
При ряде патологических состояний возникает тромбирование сосудов, что приводит к смертности при остром инфаркте миокарда и при тромбоэмболиях мозговых артерий. Тромб состоит из молекул фибрина, фактора свертывающей системы крови, образующего сеть в ответ на повреждение сосудистой стенки. Антисвертывающая система представлена плазмином (фибринолизином) – протеолитическим ферментом, находящимся в крови в неактивном состоянии (плазминоген), белками плазмы крови (протеинами С, S, антитромбином III, тормозящими процесс образо-
274
вания фибрина, а также веществами, продуцируемыми или фиксированными на эндотелиальных клетках, например, гепарин (см. главу 3). В случае не эффективности системы, предотвращающей образование фибрина, используют лекарственные препараты как активаторы плазминогена.
Рассмотрим роль плазминогена в системе растворения тромба при закупорке артерий. Плазминоген – одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 90 кDа, превращающийся в плазмин с помощью природных активатор, находящихся в небольшом количестве в органах и тканях (активаторы плазминогена тканевого типа), либо с помощью стрептокиназы. Активаторы плазминогена тканевого типа представлены ферментами и являются естественными тромболитическими агентами. Например, трипсин, находящийся в крови активирует плазминоген, превращая его в плазмин (фибринолизин). Плазмин является протеолитическим ферментом – эндопептидазой, который вызывает только наружный лизис тромба (преимущественно в венах) так как быстро нейтрализуются антиплазмином, в избытке циркулирующим в крови. Кроме того, плазмин обладает свойствами активатора, переводящего эндогенный плазминоген в плазмин. Продукты деградации фибрина, образующиеся при его разрушении, препятствует полимеризации мономеров фибрина и образованию тромбопластина.
С учетом энзиматических и иммунохимических свойств, способности связывать фибрин плазмы крови, активаторы плазминогена принято делить на активаторы тканевого типа (препарат, полученный из клеток меланомы человека и рекомбинантный тромболитический препарат – альтеплаза) и активаторы урокиназного типа (урокиназа, стрептокиназа, стрептодеказа и др.).
В настоящее время в Украине зарегистрирован и используется в клинической практике ряд препаратов: Стрептокиназа – Эберкиназа (Heber Biotec), Стрептаза (Aventis Behring), Строкиназа (Byarat Serum & Vaccines);
Альтеплаза – Актилизе (Boehringer Ingelheim); Урокиназа (Medac); Фибринолизин (Биофарма). На мировом фармацевтическом рынке присутствуют разработки препаратов: Альтеплазы – Activase (Genentech), Стрептокиназа
(Kabi Vitrum, Smith Kline, Hoechst); сконструированная химерная молеку-
ла, содержащая фрагмент активатора плазминогена тканевого типа, уроки-
275
назы и проурокиназы (Ciba-Geigy); ацилированный комплекс стрептокиназы и плазминогена (Beecham).
Альтеплаза – тромболитическое средство, гликопротеин, рекомбинантный человеческий тканевой активатор плазминогена. После внутривенного введения находится в кровотоке в неактивном виде. Связываясь с фибрином, стимулирует переход плазминогена в плазмин, который растворяет сгустки фибрина. Из-за относительной фибриноспецифичности альтеплаза при введении в терапевтической дозе лишь незначительно влияет на уровень фибриногена, плазминогена и α-2-антиплазмина крови. Антигенные свойства не выражены. Применение альтеплазы способствует снижению уровня смертности при остром инфаркте миокарда, благоприятно влияет на течение заболевания и прогноз при острой тромбоэмболии легочной артерии и ишемическом инсульте. Альтеплаза быстро выводится из кровеносного русла и подвергается метаболизму, в основном, в печени. Через 20 минут в плазме крови определяется менее 10 % от исходной концентрации активного вещества. Альтеплаза получена с использованием штаммов-продуцентов E. Coli и S. cerevisiae, в которые был введен ген активатора плазминогена тканевого типа, который расположен у человека в хромосоме 8.
Стрептокиназа – высокоочищенный фермент, получаемый при культивировании штамма -гемолитического Streptococcus группы С с молекулярной массой 40–50 кDа. Обладает фибринолитической активностью. При соединении с плазминогеном стрептокиназа образует комплекс, активирующий переход плазминогена крови или кровяного сгустка в плазмин. Плазмин растворяет сгустки фибрина, а также приводит к деградации фибриногена и других белков плазмы крови. После окончания инфузии гиперфибринолитический эффект стрептокиназы наблюдается только в течение нескольких часов, однако удлинение тромбинового времени может сохраняться до 24 часов. Вследствие одновременного снижения уровня фибриногена и увеличения числа циркулирующих продуктов деградации фибрина и фибриногена. Период полувыведения комплекса стрептокиназа – плазминоген, активирующего плазмин, составляет около 23 минут. Поскольку стрептокиназа является слабым стрептококковым антигеном, она частично инактивируется антистрептококковыми антителами, которые
276
всегда присутствуют в крови. Состояние фибринолиза достигается только при введении избыточного количества стрептокиназы, необходимого для нейтрализации антител и последующего проникновения активной стрептокиназы в тромб. Применяют фермент при остром инфаркте миокарда, тромбозе глубоких вен, острой массивной тромбоэмболии легочной артерии, тромбировании гемодиализного шунта и др.
Внастоящее время активно проводятся исследование на создание рекомбинантных препаратов стрептокиназы, например, в Украине зарегистрирован рекомбинантный препарат стрептокиназы – «Эберкиназа»
(Heber Biotec, Куба). Фирма «Phillips Petrolium» (США) запатентовала ме-
тод экспрессии фермента в S. cerevisiae, экспрессируемый в дрожжах белок по биологической активности и молекулярной массе идентичен стрептокиназе, полученной из Streptococcus (выход фермента 1 г с 1 литра среды).
Урокиназа – фермент – активатор плазминогена, получаемый из культур клеток эмбриона почки человека. Активным центром которого является аминокислота серин (синоним – сериновая протеаза). Урокиназа обладает специфическим сродством с плазминогеном и превращает плазминоген непосредственно в плазмин путем гидролиза связи аргининвалин. Оказывает фибринолитическое действие, активирует глу- и лизплазминогены, превращает их в плазмин, вызывающий ферментативное разрушение фибрина. Лизис фибрина приводит к дезинтеграции составных элементов тромба и его распаду на мелкие фрагменты, которые уносятся током крови или растворяются на месте плазмином. Образовавшиеся продукты деградации фибриногена способствуют гипокоагуляции, блокируют агрегацию эритроцитов и тромбоцитов, снижают вязкость крови. Период полувыведения не превышает 20 минут. Урокиназа не обладает выраженными антигенными свойствами, поэтому при её использовании меньшая опасность возникновения аллергических реакций и её назначают повторно. Применяют при острых тромбозах, тромбоэмболии артерий и вен, остром инфаркте миокарда, нестабильной стенокардии, тромбозе глубоких вен, тромбозе артериовенозного шунта.
Вкачестве антитромботических препаратов предложены химерные (гибридные) молекулы, содержащие активаторы плазминогена тканевого типа и урокиназы. Эти гибридные молекулы характеризуются таким же
277