Материал: Фарм производство БАР

сродством к фибрину и способностью к лизису тромбов. Химерные молекулы получают методом слияния концевой кДНК, кодирующий концевой аминосодержащий фрагмент активатора плазминогена тканевого типа, ответственный за специфичность в отношении фибрина, с кДНК, кодирующий концевой карбоксисодержащий фрагмент проурокиназы, ответственный за ферментативные свойства молекулы. По данным авторов этих исследований, данное соединение обладает специфичностью к фибрину, характерной для обеих молекул; лечебная доза этого препарата может быть в 4 раза меньшей, чем доза активатора плазминогена тканевого типа и урокиназы, вводимых отдельно. Снижение дозы – это уменьшение вероятности побочного действия.

Исследования, направленные на создание рекомбинантных препаратов тромболитиков продолжаются во многих странах с развитой фармацевтической наукой и промышленностью.

6.5. Рекомбинантные белки плазмы крови

Внастоящее время уровень производства альбумина, выделенного из плазмы крови человека, составляет около 440 тонн в год.

Во многих странах мира проводятся интенсивные разработки по получению рекомбинантного человеческого альбумина. Причин для этого несколько: дефицит донорского сырья и возможность инфицирования больных при инфузии препарата.

ВРоссии разработана программа по созданию рекомбинантного альбумина человека. Осуществлено получение новой конструкции, содержащей ген человеческого сывороточного альбумина. Проведена интеграция необходимой генетической информации в геном метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. Удалось получить новый штамм GS115/Alb2 метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, содержащего 2 копии ДНК кодирующих человеческий сывороточный альбумин. Штамм отличается высокой продуктивностью и устойчивостью к селективному антибиотику, что позволяет контролировать гомогенность культуры в производственных условиях. Выход составляет 2–3 грамма с 1 литра культуральной жидкости. По

278

мнению авторов при масштабировании процесса выход может увеличиться до 6–7 грамм с 1 литра. Первое в мире предприятие по производству рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина организовано в Японии с производительностью 40 тонн в год.

Протеин С синтезируется в гепатоцитах и является К-зависимым белком. Активированный протеин С ингибирует факторы Va и VIIIa путем частичного их протеолиза. Эта реакция происходит на поверхности фосфолипидов тромбоцитов и эндотелия сосудов в присутствии протеина С как кофактор. Активность протеина С инактивирует ингибитор активатора плазминогена, стимулируя тем самым фибринолиз. При дефиците протеина С тромбозы начинают проявляться между 20 и 30 годами жизни. Характерны появления тромбозов глубоких вен и легочной артерии. При уровне протеина С около 50 % от нормы возникает тенденция к развитию тромбозов, тромбофлебита и эмболии.

Препарат рекомбинантного активированного протеина С

«Drotrecogin alfa activated» (Zovant) (Eli Lilly& Cоmpany, США) обладает антитромботическим, противовоспалительным и профибринолитическими свойствами. Препарат получен на культуре трансформированных клеток яичников китайского хомячка. Для очистки использована аффинная хроматография на Q-сефарозе. Препарат лицензирован в 50 странах мира. Показана эффективность препарата при сепсисе – генерализованном, неадекватном, воспалительном и прокоагулянтном ответе организма на инфекцию. Препарат не оказывает эрадицирующего эффекта в отношении инфекции, обусловившей развитие сепсиса, однако существенным образом снижает интенсивность воспалительных явлений и нарушений свертываемости крови. В клиническом исследовании установлено, что применение «Drotrecogin alfa activated» снижает риск смерти у больных сепсисом на 6 %. В то же время, установлено, что побочными действиями при применении препарата являются кровотечения.

279

6.6. Биотехнология препаратов фагов

Бактериофаги (от бактерии и греч. Phagos – пожиратель), фаги – бактериальные вирусы, вызывающие лизис бактерий. Бактериофаги размножаются в клетках, лизируют их и переходят в другие клетки, как правило, молодые, растущие клетки. Впервые перевиваемый лизис бактерий (сибиреязвенной палочки) наблюдал в 1898 г. русский микробиолог Н.Ф. Гамалея. В 1915 г. английский ученый Ф. Туорт описал это же явление у гнойного стафилококка, а в 1917 г. французский ученый Ф.Д. Эрелль назвал литический агент, проходящий через бактериальные фильтры.

Частицы многих бактериофагов состоят из головки округлой, гексагональной или палочковидной формы диаметром 45–150 нм и отростка толщиной 10–40 нм и длиной 100–200 нм. Некоторые бактериофаги не имеют отростка; одни из них округлы, другие – нитевидны, размером 8 х 800 нм. Содержимое головки состоит из ДНК. Длина нити ДНК во много раз превышает размер головки и достигает 60–70 мкм. Эта нить плотно скручена в головке. Некоторые фаги содержат РНК-геном. Отросток имеет вид полой трубки, окруженной чехлом, содержащим сократительные белки. У ряда бактериофагов чехол способен сокращаться, обнажая часть стержня. На конце отростка у многих бактериофагов имеется базальная пластинка с несколькими шиповидными или другой формы выступами. От пластинки отходят тонкие длинные нити, которые способствуют прикреплению фага к бактерии. Оболочки головки и отростка состоят из белков. Общее количество белка в частице фага 50–60 %, нуклеиновых кислот – 40–50 %. Каждый бактериофаг обладает специфическими антигенными свойствами, отличными от антигенов бактерии-хозяина и других фагов. Имеются антигены общие для ряда фагов, особенно содержащих РНК.

Бактериофаги прикрепляются своим отростком к бактериальной клетке и, выделяя фермент, растворяют клеточную стенку. Затем содержимое его головки через каналец отростка переходят внутрь клетки, где под влиянием нуклеиновой кислоты фага останавливается синтез бактериальных белков, ДНК и РНК и начинается синтез нуклеиновой кислоты, а затем и белков фага. Часть этих белков ферменты, другая часть образует оболочку зрелой частицы бактериофага. О сложности строения отростка у

280

Т-четных фагов дает представление простое перечисление структурных элементов, его составляющих: муфта, шейка, воротничок, стержень, базальная пластинка, чехол, длинные и короткие фибриллы, причем каждый из этих элементов в свою очередь состоит из нескольких белков. Наличие особой и сложно устроенной органеллы, предназначенной для адсорбции фага на клетке, продиктовано тем, что бактерии имеют жесткую полисахаридную оболочку, разрешающую введение ДНК лишь по механизму инъекции, в процессе которой оболочка буквально прокалывается отростком фага. Фаговая частица, согласно существующим представлениям, рассматривается как своеобразный микрошприц, осуществляющий инъекцию своей ДНК в заражаемую клетку.

Если клетка бактерии заражена одновременно частицами бактериофагов, различающимися между собой по ряду свойств, то среди потомства, кроме частиц, подобных родителям, будут и такие, у которых эти свойства встречаются в новой комбинации, так как при размножении бактериофагов наблюдается рекомбинация – обмен участками нитей нуклеиновой кислоты. Одни бактериофаги весьма специфичны и способны лизировать клетки только одного какого-либо вида бактерий (монофаги), другие клетки разных видов (полифаги).

Бактериофаги разделяют на вирулентные, вызывающие лизис клетки с образованием новых частиц, и умеренные (симбиотические), которые адсорбируются клетками и проникают в них, но лизиса не вызывают, а остаются в клетке в латентной (скрытой) неинфекционной форме (профаг). Культуры, содержащие латентный фаг, называют лизогенными. Лизогения передается потомству бактерии. По форме фаги делятся на 4 группы: 1 – фаги, имеющие кубическую головку и отросток; 2 – кубические фаги; 3 – нитевидные фаги; 4 – плеоморфные фаги.

Современная классификация бактериофагов включает 13 семейств, подразделенных более чем на 140 видов, которые содержат 5300 видов фагов.

Строение бактериофагов мы рассмотрим на примере фага серии Т-2 E.Coli (колифаг), который приведен на рис. 19.

281

2

1

Воротничок

Чехол

Рисунок 19 – Модель фага серии Т-2:

А– Фаг с вытянутым чехлом до адсорбции;

В– Фаг с сократившимся чехлом после адсорбции и инъекции;

1– поперечный разрез вытянутого отростка: видны 6 белковых субъединиц чехла в одной плоскости; 2 – поперечный разрез

сократившегося чехла: видны 12 белковых субъединиц чехла в одной плоскости; 3 – базальная пластинка готового к адсорбции фага со свободными

нитями

Литический цикл фага складывается из нескольких этапов: адсорбция; внутриклеточное развитие фага; латентный период; созревание.

Адсорбция – процесс присоединения фаговой частицы к бактериальной клетке, которая происходит благодаря рецепторам, находящимся на клеточной мембране бактерий. Адсорбция является одним из факторов, которые определяют способность бактериофагов вызывать лизис бактериальной клетки. Существенное значение для процесса адсорбции имеет состав окружающей среды.

282

Инъекция – процесс введения ДНК фаговой частицы в бактериальную клетку. Процесс заключается в фиксации базальной пластины на клетке, сокращении хвостового чехла, в результате чего полый стержень входит в клетку, куда попадает нуклеиновая кислота; белковые структуры фага остаются вне клетки.

Латентный период – на этом этапе происходит перестройка метаболизма пораженной бактериальной клетки: останавливается синтез бактериальных ДНК, а затем прекращается синтез бактериальных белков и РНК.

Созревание – на этом этапе завершается процесс развития бактериофагов. При этом происходит объединение ДНК фагов с белком оболочки и образование инфекционных фаговых частиц. Первоначально образуются капсиды, наполненные белком. После растворения этих внутренних белков готовые головки наполняются ДНК и закрываются. После чего присоединяются компоненты хвоста. Далее клеточная стенка бактерии размягчается под действием лизоцима фага, а образовавшиеся фаги освобождаются для дальнейшего размножения.

Таким образом, каждый бактериофаг проникает в «свою бактерию» и начинают размножаться внутри бактерии. От бактерии остаются одни обломки, а на свет появляется не менее 100–200 новых фагов, готовых к нападению на бактериальные клетки. Цикл – время с момента заражения бактериофагом до выхода потомства – длится всего от 15 до 40 минут в зависимости от вида бактериофага.

Преимуществами препаратов бактериофагов перед антибиотиками являются:

способность уничтожения бактерий, устойчивых к антибиотикам, т.к. фаги специфично лизируют определенные бактерии;

проникновение в ткани организма человека и животных, не нарушая баланса высшего организма;

постоянное эволюционирование;

отсутствие побочных эффектов, и подавление нормальной микрофлоры, не ослабляют иммунитет;

не приводят к устойчивости бактерий.

Бактериофаги строго избирательны по отношению к бактериям – им не стали давать собственные имена, а дают название по бактерии.

283

Кишечные бактериофаги:

Бактериофаг брюшнотифозный (Bacteriophagum salmonellae typhi) –

смесь бактериофагов, активных в отношении возбудителей брюшного тифа различных фаготипов. Применяют для лечения и профилактики брюшного тифа.

Бактериофаг дизентерийный (Bacteriophagum disentericum) – препарат, активный в отношении дизентерийных бактерий Флекснера, зоне и Ньюкасл. Применяют для лечения и профилактики дизентерии.

Бактериофаг сальмонеллезный групп ABCDE (Bacteriophagum Salmonella ABCDE) – смесь фаголизатов сальмонелл: S. paratyphi A и B, S. Newport, S. Dublin, S. anatum, S. typhimurium, S. Heidelberg, S. cholerae suis, S. oranienburg, S. newlands. Сальмонеллезный бактериофаг применяют для лечения детей и взрослых больных сальмонеллезами, санации носителей сальмонелл, а также с профилактической целью по эпидемическим показаниям.

Бактериофаг коли-протейный (Bacteriophagum coli-proteum) – смесь бактериофагов, активных в отношении наиболее распространенных серологических групп энтеропатогенных кишечных палочек: О111, О55, О44, О20/145, О26, О124, о125 и протея. Препарат применяют для лечения детей, больных кишечными заболеваниями, обусловленных энтеропатогенными кишечными палочками, и дисбактериозов с преобладанием протея.

Раневые бактериофаги:

Бактериофаг стафилококковый (Bacteriophagum staphilococcicum) –

препарат активный в отношении штаммов стафилококка различного происхождения, выделенных с ожоговой и раневой поверхности, из крови, из носоглотки. Применяют для лечения и профилактики инфекций, вызванных стафилококком.

Бактериофаг стрептококковый (Bacteriophagum streptococcicum) –

препарат активный в отношении штаммов стрептококка различного происхождения. Применяют для лечения и профилактики кожных, хирургических стрептококковых инфекций при ангине, скарлатине.

Бактериофаг коли (Bacteriophagum coli) – препарат, активный в отношении наиболее распространенных серологических групп энтеропато-

284

генных кишечных палочек. Применяют с лечебной и профилактической целью.

Бактериофаг протейный (Bacteriophagum protei) – смесь фаголизатов, активных в отношении наиболее распространенных видов протея. Применяют в лечебных и профилактических целях.

Бактериофаг пиоцианеус (Bacteriophagum pyocyaneum) – препарат, активный в отношении штаммов синегнойной палочки. Применяют с лечебной и профилактической целью.

6.6.1. Технологические принципы получения бактериофагов

Бактериофаги встречаются в кишечнике человека и животных, в растениях, почве, водоемах, сточных водах, навозе и т.д. Расы бактериофагов, применяемые в производстве, выделяют из сточных и речных вод. Литическую активность выделенных рас проверяют с набором соответствующих культур методом Аппельмана. Наиболее активные расы используют для приготовления инокулята фагов.

После выделения соответствующего штамма бактериофага проводится изучение основных биологических свойств фага: литическую актив-

ность, антигенные свойства, интенсивность адсорбции на бактериальной клетке, латентный период внутриклеточного развития, урожайность, диапазон литической активности, специфичность, морфологию негативных колоний, морфологию фаговых корпускул, тип и размер нуклеиновых кислот. После проведения указанных исследований и подтверждения пригодности бактериофага для создания лекарственного или диагностического препарата, возможно приступить к технологическим разработкам.

Производство бактериофагов проводят в ферментерах – емкостью от 100 до 500 литров. Поскольку основным этапом микробиологического производства бактериофагов является ферментация специфичной для фага бактериальной культуры и выращивание фага, то особое внимание необходимо уделять конструкции ферментеров их автоматизации и обеспечению надежности производственного процесса. Ферментеры должны быть оснащены электронными стойками автоматического управления процессом ферментации в автоматическом режиме и контролировать такие техноло-

285

гические параметры, как значение рН, уровень растворенного кислорода – рО2, температуру, давление, число оборотов мешалки, уровень пены (при её образовании), расход подаваемого на аэрацию воздуха. Также необходимо учитывать возможность последовательной передачи биологического материала из аппаратов меньшего объема в аппараты большего объема. Для обеспечения стерильных условий ферментации и защиты окружающей среды в составе обвязки ферментера должны присутствовать стерилизующие фильтры тонкой очистки (например, фирмы «PALL Millipore»), обеспечивающие подачу в ферментер стерильного воздуха и очистку отработанного воздуха, выбрасываемого в атмосферу.

Всостав питательных сред для изготовления препаратов бакте-

риофагов входят белковые основы в виде кислотных или ферментативных гидролизатов казеина и мяса (гидролизат Хоттингера, пептон Мартена, гидролизат Глузмана и др.). В качестве источника ростовых факторов в производственных питательных средах используют мясные экстракты, в основном, с добавлением глюкозы; рН среды в пределах 7,2–7,6 в зависимости от вида бактериофага. Стерилизацию питательных сред проводят при температуре 120–124 °С, время экспозиции после достижения заданной температуры 40–60 минут в зависимости от компонентного состава среды.

Вреактор с питательной средой, охлажденной до 37 °С вносят инокулят штамма бактерий соответствующего фагу из расчета 50–150 млн. микробных тел на 1 мл среды (в зависимости от вида изготавливаемого препарата). Инокулят фага добавляют в количестве 0,01–0,1 % объема питательной среды, что определяется свойствами штамма бактерий и бактериофага. Содержимое реактора тщательно перемешивают стерильным воздухом. Воздух, подаваемый в реактор насосом, поступает через стерильный фильтр. Например, для производства препаратов дизентерийного фага Sonne S рекомендованы следующие технологические параметры: степень аэрации культуры 75 ± 5 %, содержание глюкозы 1,0 ± 0,2 мг/мл, содержание аминного азота 60 ± 7 мг/% (необходимо наличие в гидролизате аминокислот: триптофана, тирозина, валина).

Концентрация водородных ионов (рН) – важный параметр, влияющий как на рост бактерий, так и на развитие конечного продукта – бакте-

286

риофагов. По разным причинам рН в ходе ферментации имеют тенденцию к изменению, поэтому необходима схема управления для поддержания рН на оптимальном уровне (6,8–7,4). Регулирование рН осуществляется автоматически добавлением корригирующих компонентов, например, при помощи перистальтического насоса.

Лизис проходит при температуре 37 ± 0,5 °С. Продолжительность лизиса в реакторе 4–10 часов. По истечении указанного времени определяют (визуально) полноту лизиса. Полученную культуральную жидкость, содержащую бактериофаги фильтруют через фильтрующий картон, а затем через фильтры с размером 0,2 мкм. Стерильную культуральную жидкость, содержащую бактериофаги подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке через мембраны с порогом отсечения 200–300 кDa при температуре 6–10 °С. При этом, удаляются балластные компоненты с молекулярными массами менее 200–300 кDa. Так, например, при очистке препа-

рата бактериофага Serratia (S. marcescens, S. rubidaea, S. odorifera) степень очистки составила около 94 %. Эффективность очистки была подтверждена в экспериментах по изучению острой и хронической токсичности очищенных и неочищенных фаголизатов. Установлено, что степень адсорбции бактериофагов Serratia на бактериальных клетках составляет 75–99 %, длительность латентного периода внутриклеточного размножения 20–30 минут. Урожайность 10–115 фаговых частиц на 1 бактериальную клетку. При ультрафильтрации дизентерийного фага Sonne S обнаружено также снижение пирогенных свойств очищенного препарата. Полученный концентрированный очищенный препарат бактериофага подвергают стерилизующей фильтрации через фильтры с размером 0,2 мкм. В случае производства жидких форм бактериофагов стерильный продукт разливают в стерильную первичную упаковку и проводят контроль готового препарата. Контроль готового препарата проводят по следующим показателям: специфическая стерильность, безвредность, литическая активность.

Первые три стадии технологического процесса производства сухих бактериофагов не отличаются от технологии изготовления жидких фагов. Получение серии сухого фага начинается с концентрации жидкого бактериофага путем его высаливания сульфатом аммония, который добавляют в количестве 69 % от объема фага. Высаливание продолжается 6–18 часов

287