включения. Однако при рН 11,5 весьма заметна деградация белковой молекулы Г-КСФ. Также изучено влияние концентрации мочевины (от 0 до 8 М) на освобождение белка из телец включения с учетом выбранного значения рН. Установлено, что наиболее приемлемой концентрацией является
2 М.
Влажные тельцы включения (280 г) растворяли в 8 л буферного раствора (2М мочевина, 50 мМ трис-НCl, рН 11,0) и оставляли перемешиваться в течение 30 минут при комнатной температуре (солюбилизация телец включения).
3.2. Ренатурация является ключевой стадией получения рекомбинантных белков, в процессе которой белковая молекула приобретает пространственную структуру, обеспечивающую её биологическую активность. Известно, что белки, локализованные в тельцах включения, могут иметь правильную вторичную структуру. Известно, что хаотропные агенты в высоких концентрациях приводят к необратимому разрушению вторичной структуры, что значительно затрудняет проведение ренатурации и снижает выход биологически активного белка. Предложенная авторами схема проведения ренатурации сохраняла биологическую активность рекомбинантного белка.
Раствор белка, полученный после солюбилизации, добавляли к различному количеству буферного раствора (5мМ трис-НCl, 0,1 % полисорбата 20, рН 8,0; рН раствора доводили до значения 8,0 при помощи 1 М раствора уксусной кислоты). Полученный раствор медленно добавляли к 3,0 мл 1 М раствора сульфата меди и реакционную смесь оставляли при комнатной температуре и перемешивании на 16–18 часов. Затем в раствор вносили 800 мл 0,5 М раствора ЭДТА и оставляли еще на 2 часа. Затем рН смеси медленно доводили до 4,0 1 М раствором уксусной кислоты.
4. Ионообменная хроматография.
Хроматографическую очистку рекомбинантного филграстима проводили при 4 °С на радиальной колонке объемом 1 л. В качестве сорбента использовали Sp-Sepharose FF. Раствор белка после ренатурации (82 л) с помощью перистальтического насоса со скоростью 300 мл/мин наносили на радиальную колонку Sepragen 1000, уравновешенную 50мМ натрийацетатным буферным раствором, рН 4,0 (стартовый буфер). После нанесе-
258
ния всего объема белка сорбент промывали тремя объемами стартового буфера. Сорбированный белок элюировали градиентом концентрации хлорида натрия от 0 до 0,5 М в том же буферном растворе при рН 4,0. Белок отбирали в соответствии с фотометрическим профилем при длине волны
280нм; фракции, содержащие филграстим, объединяли.
5.Гель-фильтрация.
Раствор белка после ионообменной хроматографии наносили на колонку, заполненную гелем Sephadex G-25 Fine. Колонку предварительно уравновешивали буферным раствором (20 мМ ацетата натрия, 5 % сорбита, 0,004 % полисорбата 80, рН – 4,0). Тот же буферный раствор использовали для проведения элюции белка при скорости 120 мл/мин. На этом этапе белок переводили в буфер, пригодный для готового лекарственного средства. Белок в элюате детектировали с помощью проточного фотометра при длине волны 280 нм; фракции, содержащие филграстим, объединяли.
Контроль препарата проводили по следующим тестам: специфическая активность in vitro с Международным стандартом филграстима по стимуляции роста клеток линии NFS60 мышей; изоэлектрическое фокусирование для определения изоформ и примесей; определение содержания эндотоксинов с помощью гель-тромб-теста (LAL-тест) и др.
Время производственного цикла 30 ч. Выход составляет 90–110 мг субстанции из 1 литра питательной среды (10 грамм за 1 цикл)
По указанной технологии была произведена активная фармацевтическая субстанция филграстима и создана готовая лекарственная форма под названием «Нейпомакс».
В заключение необходимо отметить, что филграстим обладает стимулирующим действием на стволовые клетки, регулирует образование функционально активных нейтрофилов их выход в кровь из костного мозга, а также влияет на некоторые функции зрелых нейтрофилов, включая хемотаксис. Широкий спектр иммунобиологической активности Г-КСФ предопределил его востребованность в медицинской практике, что привело к созданию рекомбинантного препарата. Рекомбинантный человеческий КСФ применяется для лечения онкологических больных, ВИЧ-инфицированных и людей с врожденной нейтропенией, для коррек-
259
ции иммунодефицитных состояний, а также для профилактики инфекционных осложнений.
6.3.2. Факторы свертывания крови
Рекомбинантные препараты производства in vitro и их активные фармацевтические субстанции не несут в себе риска гемотрансмиссионных инфекций. По мере прогресса биотехнологического производства молекулярная структура рекомбинантных препаратов становится все более идентичной природным белкам по структуре и функциональной активности.
Проблема остановки кровотечений является актуальной для многих направлений медицины. Мировые тенденции последнего времени – это использование препаратов крови, а не её компонентов, а также использование продуктов генно-инженерных технологий, которые становятся альтернативой продуктам донорской крови.
Прежде, чем приступить к рассмотрению конкретных рекомбинантных препаратов, необходимо представить современную модель свертыва-
ния крови, состоящую из трех основных стадий:
1-я фаза – инициация процесса свертывания крови, которая развивается за счет образования комплекса тканевого фактора (TF): фактора свертывания VIIа на поверхности субэндотелиальных клеток в месте повреждения сосудистой стенки и приводит к образованию незначительного стартового количества тромбина. Тканевой фактор TF экспрессируется во многих типах клеток, в том числе в гладкомышечных, фибробластах, макрофагах, не контактирующих с кровью. При нормальных условиях большинство клеток, находящихся в прямом контакте с кровью, лишены TF. В их число входят эндотелиальные клетки кровеносных сосудов и тромбоциты, хотя рядом авторов в настоящее время этот факт оспаривается. Исключительным свойством TF является его способность связываться с фактором VII с образованием комплекса TF : VII. Важно отметить, что в отличие от других прокоагулянтов, циркулирующих в крови в неактивной форме, у здорового человека от 0,01 % до 1 % от всего количества фактора VII присутствует в кровотоке в активированной форме – VIIa.
260
2-я фаза – усиление процесса свертывания крови за счет активации тромбоцитов и целого ряда коагуляционных факторов тромбином, который образуется под влиянием комплекса TF / VIIа.
3-я фаза – распространение процесса свертывания крови с формированием теназного и протромбиназного комплексов на поверхности активированных тромбоцитов. В результате образуется значительное количество тромбина, способного сформировать сгусток фибрина. Этому процессу способствует уникальные свойства тромбоцитов, которые объясняются наличием на их поверхности высоко аффинных рецепторов для факторов
XI, XIa, IX, IXa, VIII, VIIIa, V, Va, X, Xa, протромбина и тромбина. Фор-
мирование теназного комплекса (VIIIa / IХa) требует наличия активных форм двух факторов – фактора IХa и фактора VIIIa. Установлено, что активация фактора IX достигается двумя путями. Первый путь – это активация фактора IX комплексом ТF / VIIa. Образующийся при этом фактор IХa переходит с клеток, несущих TF, на поверхность рядом расположенных тромбоцитов, практически не теряя своей активности, поскольку он не подвержен действию TFPI (ингибитор пути тканевого фактора) и очень медленно ингибируется антитромбином и другими плазменными ингибиторами протеаз. Однако критическое количество активного фактора IX, которое необходимо для остановки кровотечения, образуется другим путем – под влиянием фактора XIa, связанного с тромбоцитами.
Сегодня для терапевтических целей еще достаточно широко используются плазменные факторы, полученные из донорской крови. Учитывая роль указанных факторов в системе свертывания крови, становится понятна актуальность создания рекомбинантных препаратов, принимающих участие в коагуляции. Целью исследований является создание технологии производства рекомбинантных белков – аналогов белков донорской крови, как альтернатива производству лекарственных препаратов получаемых путем фракционирования крови.
Рекомбинантный активированный фактор VII. Активированный фактор VIIа занимает уникальное место в обеспечении гемостаза. Вопервых, непосредственно в месте повреждения сосуда фактор VIIа, соединившись с тканевым фактором – TF, активирует фактор IX и фактор X. Фактор Xa в этом же месте превращает небольшие количества протромби-
261
на в тромбин. Это небольшое количество тромбина достаточно для диссоциации комплекса, состоящего из фактора VIII и фактора Виллебранда, и активации тромбоцитов для обеспечения возможности связывая фактора IХa с соответствующими рецепторами тромбоцитов.
Во-вторых, фактор VIIa может и непосредственно активировать фактор X при отсутствии TF, но при наличии достаточного количества фосфолипидов на поверхности активированных тромбоцитов.
Таким образом, фактор VIIа запускает процесс коагуляции по шунтирующему пути, активируя фактор Х в обход факторов VIII и IX, т.е. фактор VIIа стимулирует образование тромбина в отсутствие факторов
VIII и IX.
Фактор VII свертывания крови является белком-протеазой, с молекулярной массой 50 кDа. Он принадлежит к группе Витамин К-зависимых коагуляционных протеаз. Фактор VII состоит из одной пептидной цепи из 406 аминокислот. Активирование фактора VII происходит благодаря специфическому расщеплению в точке Arg 152.
Препарат рекомбинантного фактора VIIа «Novo Seven» (Novo Nordisk, Дания) используется у больных ингибиторной формой гемофилии А и В и во многих случаях он эффективен в ситуациях, когда все другие методы лечения ингибиторной формы гемофилии оказываются безрезультатными. Кроме того, фактор VII применяется у пациентов с тяжелой степенью недостаточности фактора VII; болезнью Виллебранда; дефицитом фактора XI; кровотечением на фоне приобретенных коагулопатий; кровотечении на фоне тромбоцитопенией различного генеза (болезнью Гланцмана, синдром Бернара – Сулье); передозировкой кумаринов (ятрогенный дефицит фактора VII вследствие ингибирования гамма-карбоксилирования в печени). Получение рекомбинантного фактора VIIа проводят на культуре клеток почек хомяка.
В России сегодня производится препарат VII фактора человека «Коагилл» (Фармстандарт), в состав которого входит субстанция эптаког-альфа (активированная) – VIIа (молекулярная масса 50 кDа), полученная методом генной инженерии из клеток почек хомячков (ВНК-клетки). Потребность в субстанции фактора VII в России составляет около 200 грамм.
262
Представляют интерес данные, полученные учеными Гематологического научного центра РАМН, института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова и российской фармацевтической компании ЗАО «Мастерклон». Авторами предложена плазмидная ДНК pEFZeoF7, содержащая последовательность полипептида коагуляционного фактора VII человека. Получен штамм BHK/F7 эукариотических клеток BHK (клетки почек хомячка), содержащих рекомбинантную плазмиду ДНК pEFZeoF7, кодирующую коагуляционный фактор VII человека. Предложенная учеными экспрессионная конструкция, содержащая последовательность полипептида коагуляционного фактора VII человека отличается от известных конструкций по следующим данным:
состоит из 6296 п.о., молекулярная масса – 4,16 МDа;
включает XhoI-BgIII/BamHI фрагмент плазмиды pEFZeoF7, содержащей ген Amp (R), обеспечивающий устойчивость трансформированных клеток к ампициллину; ген, обеспечивающий устойчивость трансформированных клеток к зеоцину;
уникальные участки узнавания следующих рестриктаз – NotI
(31 п.о.), XhoI (61 п.о.), pstI (1142 п.о.), BamHI (1946 п.о.).
Выход рекомбинантного фактора VII человека около 4 мкг/мл культуральной среды, что в четыре раза выше, чем у других производителей. Применение рекомбинантных препаратов позволяют освободиться от трансмиссионных инфекций.
Рекомбинантные факторы VIII и IX. Первый рекомбинантный фактор VIII с альбумином в качестве стабилизатора был лицензирован в 1992 году. Позднее был создан препарат второго поколения (с делецией В-домена), не содержащий альбумин. Для лечения гемофилии используется несколько препаратов содержащих рекомбинантный фактор VIII: «Kogenate FS» (Bayer Corporation), «Helixate FS» (Aventis-Behring), «Recombinate» (Baxter Hyland Immuno), «ReFacto» (Genetics Institute). Эти препараты находятся на фармацевтическом мировом рыке с 2000 года.
Первоначально для препаратов, например, «Kogenate FS» (молекулярная масса – 80 кDа, получен на культуре почек хомячков) использовалась среда для клеточной культуры, содержащая раствор белков плазмы крови человека и рекомбинантный инсулин. Процесс очистки включал
263
этап вирусной инактивации с использованием сольвент / детергентной обработки; этапы ионообменной хроматографии и иммуноаффинной хроматографии с моноклональными антителами. Производители препаратов провели валидационные исследования и доказали, что предлагаемые методы очистки позволяют устранить инфективность препарата, что гарантирует проявление трансмиссионных инфекций (модельные эксперименты проведены на губчатой энцефалопатии и ряде вирусов).
Необходимо отметить, что производители указанных препаратов проводят постоянное совершенствование технологии и повышение уровня качества продукта. Так, например, из состава «Kogenate FS» и «ReFacto» был удален альбумин. В 2008 году был получен рекомбинантный фактор VIII, в технологии которого: культивирование клеточной линии проводилось без альбумина; при проведении аффинной хроматографии моноклональные антитела были заменены на синтетический полипептидный лиганд; стадия нанофильтрации проведена на фильтре с размером пор 35 нм.
Таким образом, на стадии высоко избирательной аффинной хроматографии применяется синтетический лиганд, разработанный для устранения потенциального заражения мышиными вирусами. Определение низкомолекулярных лигандов проводится при помощи метода докинга in silico – скрининга библиотек химических соединений для поиска новых аффинных сорбентов на основе низкомолекулярных пептидов или новых лекарственных средств. Синтетический лиганд зафиксирован на смоле для хроматографии. Лиганд известен под названием TN 8.2. При сравнении эффективности проведения аффинной хроматографии с синтетическим лигандом и мышиными моноклональными антителами выявлены следующие преимущества лиганда: выход составляет 85 %, а при использовании антител 63 %. Удаление белков яичника хомячков при использовании лиганда в 1,15 раза выше, чем при работе с антителами.
По данным профессора Б. Колвина из Великобритании уровень TN 8.2 в лекарственной субстанции крайне низкий – не более 1 промиля. TN 8.2 не токсичен при избытке в 300 млн. раз на животной модели и не создает помех при определении коагуляционной активности при избытке в 1 млн. раз. Кроме того, достаточно как минимум одной обработки продукта для удаления TN 8.2. В результате разработки получен препарат реком-
264
бинантного фактора VIII высокой степени очистки: примеси ДНК клеток хомячков не более 10 пг/МЕ; примеси протеина клеток хомячков не более
80 пг/МЕ.
Препарат рекомбинантного фактора IX был разработан в 1997 после осуществления клонирования соответствующего гена и лицензирован в 1999 году. Это белок отличается от естественного количеством посттрансляционных модификаций и фармакокинетикой, обуславливающей более высокую дозировку. Препарат, получивший название «Benefix» до сегодняшнего дня является единственным продуктом, который в настоящее время имеется в продаже. Ключевые стадии производства рекомбинант-
ного фактора IX можно определить как:
1.Стабильное внедрение генов фактора IX в клетки яичников китайского хомячка;
2.Отбор клеточной линии, способной экспрессировать большие количества активного рекомбинантного фактора IX при культивировании в биореакторе в питательной среде, которая полностью освобождена от продуктов крови или плазмы;
3.Очистка рекомбинантного фактора IX с использованием нанофильтрации и хроматографии без применения моноклональных антител на Q-сефарозе FF. Нанофильтрация на мембранах «Виресол-70» включена для: повышения уровня вирусной безопасности и удаления протеинов и вирусов с молекулярной массой более 70 кDа. Стадия хроматографии и нанофильтрации прошли валидацию в плане доказательства удаления вирусов с использованием модельных экспериментов с участием 3–4 видов вирусов.
Фактор VIII применяют при заболевании гемофилии А, болезни Виллебрандта (лечение и профилактика кровотечений, в том числе во время хирургических вмешательств); приобретенный дефицит VIII фактора, заболевания, сопровождающиеся образованием антител к фактору VIII.
Фактор IX применяют при геморрагическом синдроме при дефиците фактора IX (врожденном или приобретенном) гемофилии В и А (монотерапия или в сочетании с ингибиторами фактора VIII), передозировка антикоагулянтов кумаринового ряда или необходимость проведения вмешательств на фоне их применения.
265
6.3.3. Факторы некроза опухоли
Факторы некроза опухоли (Tumor necrosis factor alpha – TNF ) полу-
чили название по своему биологическому эффекту – способности оказы-
вать цитотоксическое действие на опухолевую клетку за счет генерации активных форм кислорода и окиси азота, вызывая геморрагический некроз опухоли, не повреждая нормальные клетки организма. Кроме опухолевых клеток, фактор некроза опухоли обладает способностью ликвидировать клетки, пораженные вирусом.
В настоящее время, известен фактор некроза опухоли- (ФНО ) и фактор некроза опухоли- (ФНО ). ФНО продуцируется моноцитами, активированными макрофагами, Т-клетками и другими клетками в организме и стимулирует лимфоциты, фибробласты, разрушает инфицированные и трансформированные клетки. ФНО по механизму действия относится к цитокинам. ФНО (он же лимфотоксин- – ЛТ ) продуцируется Т-клетками и стимулирует лимфоциты, нейтрофилы, эозинофилы, фибробласты, разрушает инфицированные и трансформированные клетки.
ФНО представляет собой полипептид с молекулярной массой около 17 кDa, состоящий из 157 аминокислотных остатков. Первоначально открыт в 1975 году, как вещество способное вызывать некроз саркомы мышей. Позднее было показано, что он способен вызывать лизис опухолевых клеток различных линий, и не действует на нормальные клетки организма. К настоящему времени показано, что ФНО обладает различными биологическими активностями, играет ключевую роль в иммунной и воспалительной реакциях организма. На фармацевтическом рынке ФНО представлен несколькими поколениями:
препараты, содержащие ФНО , представляющие экстракты тимуса млекопитающих;
синтетический ФНО , полученный путем химического синтеза;
ФНО , полученный путем культивирования клеток (например, человеческие периферические моноциты крови или перевиваемая культура HL-60 человеческой клеточной линии) и последующей очисткой фактора;
рекомбинантный ФНО , полученный путем биосинтеза с использованием E. Coli.
266
ФНО представляет собой полипептид с молекулярной массой около 20 кDa. Рекомбинантный ФНО человека представляет собой негликозилированный полипептид с молекулярной массой около 17 кDa, идентичен природному полипептиду ФНО человека с 22-й по 177. Аминокислоту, метилированный с N-конца. Рекомбинантный ФНО сохраняет свойства природного, вызывает некроз некоторых видов опухолей и является иммуномодулятором широкого спектра действия. ФНО обладает выраженным противовирусным действием, описаны также его радиопротекторные свойства.
Рассмотрим несколько технологических схем получения факторов некроза опухолей, в частности, типовую схему получения фактора пу-
тем культивирования клеток и последующей очисткой белковой молекулы.
1.Человеческие периферические моноциты крови используют для получения фактора некроза опухоли (моноциты должны быть использованы в течение 24 часов после сбора). Разделение моноцитов и эритроцитов достигается центрифугированием на Фиколл-Гипак градиентах при 1000 g
втечение 30 минут. Клетки, собранные на разделе фаз, трижды промывают забуференным фосфатным солевым раствором. Моноциты, полученные от каждого донора, выращивают отдельно в 2-х литровых вращающихся колбах среде RPMI 1640 (без сыворотки) при плотности клеток 2,5 х 106 клеток/мл. Прибавляют к культуре по 1 мкг/мл каждого индуктора: стафилококкового энтеротоксина В и рекомбинантного тимозин-α1 и инкубируют клетки в увлажненной атмосфере при 37 °С с 10 % СО2. После 24–72 ч, собирают клетки (от каждого донора) надосадочного слоя фильтрацией через 3 мкм Синклин фильтр. Прозрачный фильтрат испытывают на активность фактора некроза опухолей и используют для последующей очистки.
2.Полученный на стадии 1 фильтрат обрабатывают стеклянными шариками с контролируемыми порами для абсорбции ФНО на шариках. Шарики уравновешены 10 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 8,0. Процесс проводят при постоянном перемешивании и температуре 4 °С, используя 100 мл стеклянных шариков на 5 л среды. После 1 часа перемешивания, шарикам дают отстояться и декантируют надосадочный слой. Затем шарики переносят в колонку (5 х 50 см) при комнатной температуре и
267