Материал: Фарм производство БАР

ГЛАВА 1. БИОТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

Наиболее активно развивающейся областью биотехнологии является фармацевтическая биотехнология. Мировой рынок фармацевтической продукции, полученной с помощью биотехнологических методов, составляет половину всего фармацевтического рынка. Существенным сегментом фармацевтической биотехнологии являются генно-инженерные препараты, полученные с использованием рекомбинантной ДНК. Причем, приме-

нение генной технологии используется для получения не только моноклональных антител, вакцин, цитокинов, различных биологических факторов, но и антибиотиков, витаминов и других лекарственных субстанций. В данной главе мы остановимся на биотехнологии рекомбинантных ДНК, используемых для этого продуцентах и основных технологических принципах получения рекомбинантных продуктов.

1.1. Продуценты для генно-инженерной биотехнологии

В качестве продуцентов, используемых в биотехнологии рекомбинантных ДНК, применяются прокариотические и эукариотические клетки.

Бактериальные клетки. Бактерия E. Coli – грамотрицательная непатогенная подвижная палочка длиной менее 1 мкм. Её средой обитания является кишечник человека, но она также может высеваться из воды и почвы. Благодаря способности размножаться простым делением на средах, содержащих только ионы Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NH4+, Cl-, HPO42-, SO42-, микроэлементы и источник углерода (например, глюкозу), E. Coli стала излюбленным объектом для научных исследований. При культивировании E. Coli на обогащенных жидких питательных средах, содержащих аминокислоты, витамины, соли, микроэлементы и источник углерода, время генерации (т.е. время между образованием бактерии и её делением) в логарифмической фазе роста при температуре 37 °С, составляет примерно 22 мин. E. Coli можно культивировать как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Однако для оптимальной продукции рекомбинантных белков E. Coli (и другие микроорганизмы), обычно, выращивают в аэробных условиях. Помимо E. Coli в биотехнологии используют ряд других микроорганизмов:

8

Acremonium chrysogenum, Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Corynebacterium glutamicum, Erwinia herbicola, Pseudomonas spp., Rhizobium spp., Streptomyces spp., Trichoderma reesei, Xanthomonas campestris, Zymomonas mobilis и др. Их можно разделить на две группы:

микроорганизмы как источники специфических генов;

микроорганизмы, созданные генно-инженерными методами для решения определенных задач.

К специфическим генам относится, например, ген, кодирующий термостабильную ДНК-полимеразу, которая используется в широко применяемой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот ген был выделен из термофильных бактерий и клонирован в E. Coli.

Ко второй группе микроорганизмов относятся, например, различные штаммы Corynebacterium glutamicum, которые были генетически модифицированы с целью повышения продукции промышленно важных аминокислот.

Дрожжевые клетки. Синтезированный бактериальной клеткой эукариотический белок часто приходится подвергать ферментативной модификации, присоединяя к белковой молекуле низкомолекулярные соединения (во многих случаях это необходимо для правильного функционирования белка). К сожалению, E. Coli и другие прокариоты не способны осуществлять эти модификации, поэтому для получения полноценных эукариотических белков используют Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae – это непатогенные одноклеточные микроорганизмы с диаметром клетки примерно 5 мкм, которые во многих отношениях представляют собой эукариотический аналог E. Coli. Их генетика, молекулярная биология и метаболизм детально изучены. S. cerevisiae размножаются почкованием и хорошо растут на такой же простой среде, как и E. Coli. Их способность к превращению сахара в этанол и углекислый газ издавна использовались для изготовления алкогольных напитков и хлеба. Ежегодно в мире расходуется 1 млн. тонн S. cerevisiae. В 1996 году была определена полная нуклеотидная последовательность всего набора хромосом S. cerevisiae, что еще более повысило ценность этого микроорганизма для научных исследований. В настоящее время, кроме S. cerevisiae исполь-

зуются и другие виды дрожжей: Klueveromyces lactis, Saccharomyces

9

diastaticus, Schizisaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris,

Hansenula polymorpha. Наиболее эффективными продуцентами рекомбинантных белков являются P. pastoris и H. polymorpha. Сегодня, с использованием дрожжевых клеток получены интерфероны, компоненты вакцин.

Эукариотические клетки. При всех различиях между типами эукариот, методические подходы к культивированию клеток насекомых, растений и млекопитающих имеют много общего. Первоначально берут небольшой кусочек ткани данного организма и обрабатывают его протеолитическими ферментами, расщепляющими белки межклеточного материала (при работе с растительными клетками добавляют специальные ферменты, разрушающие клеточную стенку). Высвободившиеся клетки помещают в сложную питательную среду, содержащую аминокислоты, антибиотики, витамины, соли, глюкозы и факторы роста. В этих условиях клетки делятся до тех пор, пока на стенках емкости с культурой не образуется клеточный монослой. Если после этого не перенести клетки в емкости со свежей питательной средой, то рост прекращается. Обычно удается переносить (перевивать, субкультивировать) и поддерживать до 50–100 генераций исходной (первичной) культуры, затем клетки начинают терять способность к делению и гибнут. Часто некоторые клетки перевиваемых первичных клеточных культур претерпевают генетические изменения, в результате которых ускоряется их рост. Культуры клеток, которые при этом приобретают селективные преимущества, оказываются способными к неограниченному росту in vitro и называются устойчивыми клеточными линиями. У боль-

шинства клеток, способных к неограниченному росту, имеются значительные хромосомные изменения, в частности отмечается увеличение числа хромосом и потеря других. В биотехнологии устойчивые клеточные линии иногда используют для размножения вирусов и для выявления белков, которые кодируются клонированными последовательностями ДНК. Кроме того, они применяются для крупномасштабного производства вакцин и рекомбинантных белков.

Преимущества и недостатки различных штаммов-продуцентов рекомбинантных продуктов приведены в табл. 1.

10

Таблица 1 – Характеристика штаммов-продуцентов рекомбинантных белков

Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии у про-

кариот наиболее важны следующие:

тип промотора и терминатора транскрипции;

прочность связывания мРНК с рибосомой;

число копий клонированного гена и его локализация;

конечная локализация синтезируемого продукта;

эффективность трансляции в организме хозяина;

стабильность продукта в клетке-хозяине.

Для получения гетерологичных рекомбинантных белков с клонированной эукариотической комплементарной ДНК (кДНК) обычно используются прокариотические системы экспрессии. Однако в некоторых случаях эукариотические белки, синтезированные в бактериях, оказываются нестабильными или биологически неактивными. Кроме того, как бы тщательно не проводилась очистка, конечный продукт может быть загрязнен токсичными веществами или пирогенами. Чтобы решить эти проблемы, для получения рекомбинантных белков, предназначенных для использования в медицине, были разработаны эукариотические системы экспрессии. Такие белки должны быть идентичны природным по своим биохимическим, физическим и функциональным свойствам. Неспособность прокариот синтезировать аутентичные варианты белков обусловлена в основном отсутствием у них адекватных механизмов внесения специфических посттрансляционных модификаций. Белки в клетках эукариот претерпевают следующие посттрансляционные изменения:

образование дисульфидных связей (эту реакцию катализирует фермент дисульфидизомераза). Неправильно уложенный белок оказывается нестабильным и неактивным;

протеолитическое расщепление предшественника, удаление определенного участка полипептидной цепи с образованием функционально активного белка;

гликолизирование (основная модификация, благодаря которой белки приобретают стабильность, а в некоторых случаях – особые свойства). Наиболее распространенная реакция гликозилирования (присоединение специфического сахарного остатка либо к серину или треонину (О-гликозилирование), либо к аспарагину (N-гликозилирование));

12

модификации аминокислот в составе белка: фосфолирование, ацетилирование, ацилирование, гамма-карбоксилирование, сульфатирование, миристилирование и пальмитоилирование.

Для эффективной экспрессии любого гена совершенно необходимо наличие сильного регулируемого промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к РНК-полимеразе, поэтому прилегающие к нему последовательности эффективно транскрибируются. Регулируемость промотора позволяет клетке осуществлять строгий контроль транскрипции. Для экспрессии клонированных генов широко используется промотор хорошо изученного лактозного оперона E. Coli. Однако есть и другие промоторы, обладающие полезным для контроля экспрессии свойствами. Для их идентификации перед так называемым геном-репортером, кодирующим легко регистрируемый продукт, но лишенным промотора, встраивают случайные фрагменты ДНК. Если в результате такой вставки ген-репортер эффективно экспрессируется, то делают вывод, что клонированный фрагмент содержит функциональный промотор. Большинство генов-репортеров кодируют либо продукты, обуславливающие устойчивость к антибиотикам, либо фермент, который идентифицируется с помощью достаточно простого колориметрического теста. Использование генов-репортеров позволяет проводить мониторинг рекомбинантных векторов, анализировать активность, например, вирусных промоторов, намечать пути регуляции и переключения генов, осуществлять количественную оценку продуктов экспрессии. В качестве геноврепортеров используют: хлорамфеникол-ацетилтрансферазу, стрептомицинфосфотрансферазу, люциферазу светлячка, бактериальную люциферазу, гентамицин-ацетилтрансферазу и ряд других.

Таким образом, для получения белка с полным набором специфических модификаций необходимо провести тестирование различных эукариотических систем экспрессии и найти систему, которая воспроизводила бы биологически аутентичный продукт.

Эукариотические экспрессирующие векторы имеют такую же струк-

туру, что и их прокариотические аналоги и должны содержать:

эукариотический селективный маркер;

эукариотический промотор;

13

соответствующие эукариотические сайты терминации транскрипции и трансляции;

сигнал полиаденилирования мРНК.

1.2.Технологические принципы получения рекомбинантных продуктов

Технология рекомбинантных ДНК – это совокупность эксперимен-

тальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой. В настоящее время можно вырезать отдельные участки ДНК, получать нуклеотиды на ДНК синтезаторах практически в неограниченных количествах, определять последовательность нуклеотидов (разделяя, секвенируя их) сотнями в сутки, изменять выделенный ген, вводить его вновь в геном культивируемых клеток или эмбриона животного, где этот измененный ген начинает функционировать.

Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помо-

щью ряда ферментов – обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложного процесса, прежде всего ферментов рестрикции (рестрицирующих эндонуклеаз, рестриктаз). Рестриктазы являются составной частью системы рестрикции – модификации прокариотических клеток. Эта система связана с защитой клеток от проникновения чужеродной ДНК. Система модификации осуществляет метилирование собственной ДНК в сайтах её узнавания немедленно после репликации. Чужеродную ДНК, проникающую в клетку, бактерии гидролизуют с помощью рестриктаз.

Различают три основных класса рестриктаз. Рестриктазы класса I разрывают молекулы ДНК в произвольных точках, рестриктазы I и III классов обладают метилирующей и эндонуклеазной активностью. Ферменты II класса, которые и используются в генной инженерии, состоят из двух отдельных белков: рестрикционной эндонуклеазы и модифицирующей метилазы. Именно использование рестриктазы класса II позволило проводить молекулярное клонирование, так как этот фермент узнает определен-

14

ные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляет обе цепи.

В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы. Для их культивирования необходимы оптимальные условия (температура, состав и рН среды, концентрация кислорода и т.д.). С целью повышения продуктивности и стандартизации процесса получения этих ферментов клонируют гены рестрицирующих эндонуклеаз в E. Coli.

При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенных участках (сайтах). Одна из первых рестрицирующих эндонуклеаз типа II была выделена из бактерии E. Coli, получивших название Eco RI. Этот фермент узнает участок ДНК, содержащий специфическую последовательность из шести пар оснований, и вносит разрыв между остатками гуанина и аденина в каждой цепи, расщепляя связь между атомом кислорода при 3'-углеродном атоме сахарного остатка одного нуклеотида и фосфатной группой, присоединенной к 5'-углеродному атому сахарного остатка соседнего нуклеотида. Разрывы цепи в ДНК располагаются наискось друг от друга, в результате чего образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из четырех нуклеотидов в каждом («липкие концы»). Каждый одноцепочечный «хвост» заканчивается 5'-фосфатной группой, а 3'-гидроксильная группа противоположной цепи как бы утоплена. Каждый фермент рестрицирующих эндонуклеаз «опознает» в ДНК специфическую последовательность из 4–6 нуклеотидов. Кроме рестриктаз, расщепляющих нуклеотидную цепь с образованием «липких концов», существуют рестриктазы, вносящие разрывы в цепи строго друг против друга с образованием ДНК с «тупыми концами».

Однако ферментов рестрикции при молекулярном клонировании недостаточно, так как водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют «липкие концы», не столь прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы служит фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных

15

цепей, которые удерживаются вместе при спаривании «липких концов». ДНК-лигаза сшивает и «тупые концы».

Таким образом, одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая – содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Кроме того, при ДНК-рестрикции образуются разнообразные фрагменты и после их лигирования (соединения фосфодиэфирной связью) с векторной ДНК появляется множество различных комбинаций фрагментов, например, объединяются между собой фрагменты донорной ДНК и векторные ДНК. Для уменьшения количества последних, рестрицированную векторную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой.

1.2.1. Векторы для введения рекомбинантных ДНК

Для введения рекомбинантной ДНК применяют два основных вектора: плазмиды и бактериофаги.

Плазмиды – внехромосомный генетический элемент, способный к длительному автономному существованию и репликации. Обычно это двухцепочечная кольцевая ДНК. Плазмиды есть практически у всех бактерий. Размеры плазмид достигают до 500 т.п.н. Плазмиды содержат сайты начала репликации (ori), определяющие репликацию в клетке-хозяине, без этих сайтов репликация была бы невозможна. Плазмиды могут быть представлены в клетке 10–100 копиями (высококопийные плазмиды) или 1–4 копиями (низкокопийные плазмиды). На долю плазмидной ДНК обычно приходится 0,1–5,0 % суммарной клеточной ДНК. Одни плазмиды содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F–плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R–плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации).

Свойства высокоэффективного плазмидного вектора определяются следующими параметрами:

 небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в E. Coli значительно снижается при длине плазмиды более

15 т.н.п.;

16

наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка;

наличие одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Плазмидные векторы создаются при помощи генной инженерии. Одним из первых векторов был создан плазмидный вектор pBR 322 (см. Глоссарий – «Фармацевтическая биотехнология: Технология производства иммунобиологических препаратов»). Для отличия трансформированных клеток используют специальные маркеры. В качестве маркеров плазмида может содержать гены, определяющие устойчивость бактерии к антибиотикам. Вставка чужеродного (донорного) гена в маркерный ген приводит к инактивации последнего. Это позволяет отличать трансформированные клетки, получившие векторную плазмиду (утратившие устойчивость к антибиотику), от клеток, получивших рекомбинантную молекулу (сохранивших устойчивость к одному, но утративших устойчивость к другому антибиотику). Этот прием называется инактивацией маркера вставки. Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на резистентность к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).

Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клетки-хозяина называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов).

Следующим этапом является процесс трансформации – введение рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина.

Вводят плазмиды в соматические клетки с помощью химических реагентов, повышающих проницаемость клеточной оболочки. В частности, чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором кальция хлорида, затем выдерживают при 42 °С в течение 1,5 мин. Эта обработка приводит к локальному разрушению клеточной стенки. Максимальная частота трансформации – 10-3, т.е. на каждую тысячу клеток приходится одна трансформация. Частота трансформа-

17