дили до значения рН – 6,3. Элюцию белка осуществляли в градиенте натрия хлористого от 0 до 1,0 М при значении рН от 6,3 до 8,3. Дельтаферон полностью элюировался с сорбента в виде узкого пика, при этом чистота полученного препарата была более 98 %.
В настоящее время разработаны методы получения субстанций различных видов получения рекомбинантных интерферонов (интерфе- рон-α-2b, интерферон-α-2а, -интерферон, δ-интерферон и др.) и их готовых лекарственных форм, многие из которых нашли широкое применение в медицине.
6.2.2. Технология получения интерлейкинов
На сегодняшний день существуют десятки вариантов технологий получения рекомбинантного интерлейкина-2, отличающиеся используемыми штаммом-продуцента, структурой плазмиды, методами концентрации и очистки фармацевтической субстанции препарата. Мы приводим одну из технологий получения интерлейкина-2, нашедшую практический вариант реализации. Рекомбинантный интерлейкин-2 получен биотехнологическим методом из клеток продуцента – рекомбинантного штамма непатогенных пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в генетический аппарат которых встроен ген интерлейкина-2 человека. Он представляет собой полипептид, состоящий из 133 аминокислот с молекулярной массой 5,4 кDa.
Первоначально проводят получение культуры продуцента интерлей- кина-2. Для этого в отобранный трансформант дрожжей вводят плазмиду pJDB. Данная плазмида содержит промотор и терминатор транскрипции гена РН05 дрожжей, кодирующую часть гена интерлейкина-2, обеспечивающего синтез рекомбинантного интерлейкина-2 клетками дрожжей при отсутствии неорганических фосфатов в культуральной среде.
Технология получения и очистки интерлейкина-2:
1. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae GRF 18-pJDB выращи-
вают в 2-х литрах минеральной среды SC, в состав которой входит 0,67 % дрожжевого пептона, 2 % глюкозы и L-гистидин в количестве 50 мг/мл. Культивирование дрожжей проводят в течение 48 часов при температуре 30 °С и постоянном перемешивании при 170–190 об/мин.
248
2.Выращенные дрожжевые клетки отделяют центрифугированием. Полученный осадок промывают стерильной водой для инъекций и переносят в 4 литра свежей минеральной среды аналогичной по составу питательной среде SC, но имеющей пониженное содержание неорганических фосфатов (вместо 1500 мг/л однозамещенного фосфата калия в среде содержится 1500 мг/л калия хлорида и 30 мг/л однозамещенного фосфата калия). Культивирование дрожжей проводят в течение 24–48 часов при температуре 30 °С и постоянном перемешивании при 170–190 об/мин. Интер- лейкин-2 секретируется в культуральную среду.
3.После достижения оптической плотности культуры дрожжей 5–8 ед. при 600 нм, культуральную среду отделяют от клеток центрифугированием. При росте в аэробных условиях клетки значительно подкисляют среду в интервале рН от 3,5 до 5,5. При необходимости доводят величину рН культуральной жидкости до 4,8 добавлением раствора едкого натра. Выход интерлейкина-2 составляет 30–50 мг биологически активного рекомбинантного белка на 1 литр культуральной жидкости.
4.В культуральную жидкость вносят 150 мл суспензии сорбента СМ-сефадекса G-25 или СМ-целлюлозы. Суспензию медленно перемешивают в течение 3-х часов при температуре около 4 °С. За это время интер- лейкин-2 сорбируется на поверхности сорбента. Сорбент отделяют декантацией, трижды промывают 0,5 л 30 мМ натрий цитратного буфера, рН 4,8
исуспендируют в 0,4 л 1,5 М натрий цитратного буфера с величиной рН – 4,8.
5.Суспензию медленно перемешивают в течение 8 часов при температуре 4 °С. На этой стадии происходит десорбция белков с сорбента. Раствор отделяют декантацией. К сорбенту для промывки прибавляют 0,2 л 1,5 М натрий цитратного буфера с величиной рН 4,8. Элюаты, содержащие интерлейкин-2 объединяют, подвергают центрифугированию при 10000 об/мин в течение 10 минут и наносят на колонку с обращено фазовым носителем.
6.Хроматографию проводят на колонке с носителем в обращенной фазе (средний размер зерна 10 мкм). Смолу уравновешивают 0,1 % раствором трифторуксусной кислоты, наносят раствор интерлейкина-2 со скоростью 10 мл/мин и проводят элюцию при помощи элюента (элюент А –
249
0,1 % раствор трифторуксусной кислоты; элюент В – 0,1 % раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле). Пробы собирают по 15–18 мл. Оптическую плотность определяют при 280 нм.
7.Интерлейкин-2 обнаруживается в конце хроматографии в области градиента соответствующей примерно 55 % концентрации ацетонитрила. Из фракций в той области, в которой предполагается элюция интерлейки- на-2 отбирают аликвоты по 100 мкл. Аликвоты высушивают в вакууме, растворяют в 0,125 М трисгидрохлоридном буфере, рН – 6,8, содержащем 1,0 % додецилсульфата натрия и 1,0 % меркаптоэтанола. Образцы прогревают при 100 °С в течение 2-х минут.
8.Подготовленные указанным способом пробы анализируют при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в стандартной системе буферных растворов. Результаты электрофореза позволяют точно определить границы пика интерлейкина-2.
9.Фракции, содержащие интерлейкин-2, объединяют, добавляют маннитол до концентрации 5 мг/мл и подвергают лиофильному высушива-
нию. Биологическая активность рекомбинантного интерлейкина-2, очищенного по приведенной схеме, соответствует биологической активности не рекомбинантного интерлейкина-2 человека, очищенного из культу-
ры человеческих клеток. Активность составляет 10–30 млн. интерлейкиновых единиц/мг белка. Продукт содержит более 90 % основного вещества. Рекомбинантный интерлейкин-2 человека, синтезированный в клетках дрожжей, обладает биологической активностью, обеспечивая пролиферацию интерлейкин-2 зависимых Т-лимфоцитов мышей линии CTLL-2. Активность рекомбинантного интерлейкина-2 составляет не менее 10 млн. ед. на литр.
Для очистки рекомбинантных белков, в частности, интерлейкина-2 предложено получать химерный белок, который не только стабилизирует пептидную молекулу цитокина, но и позволяет упростить процедуру очистки. Так, плазмидная конструкция Saccharomyces cerevisiae, содержащая ген человеческого интерлейкина-2 с присоединенным к нему сегментом ДНК, кодирующий маркерный пептид Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,
выполняет двоякую функцию: обеспечивает стабилизацию продукта гена интерлейкина-2 и облегчает его очистку. Химерный белок, образующийся
250
после экспрессии этой генетической конструкции в дрожжевых клетках, может быть очищен за один прием с помощью иммуноаффинной хроматографии. Для этого моноклональные антитела к маркерному пептиду фиксируют на полипропиленовом носителе (подложке) и пропускают через колонку химерный белок, который связывается этими антителами. Маркерный пептид – небольшая молекула, на его образование расходуется лишь малая часть клеточных ресурсов. Химерный белок обладает такой же биологической активностью, что и нативный интерлейкин-2. Однако, если он предназначен для применения в клинике, то маркерный пептид необходимо удалить. Для этого используют бычью энтерокиназу, которая расщепляет связь между пептидом и молекулой интерлейкина. Несомненный интерес представляют разработки, позволившие получить модифицированный рекомбинантный белок, например, комплекс: альбумин человека – интерлейкин-2 или комплекс: дифтерийный токсин – интерлейкин-2.
Сегодня известно две формы интерлейкина-1: альфа и бета. В отличие от интерлейкина-1α синтезируемого сразу в активной форме, интер- лейкин-1 синтезируется в виде предшественника молекулярной массой 33 кDa, активная форма которого образуется в результате отщепления части предшественника ферментами, например, каспазой-1 или матриксными металлопротеиназами.
Интерлейкин-1 получают биотехнологическим путем, используя рекомбинантный штамм E. Coli.
Приводим технологию получения рекомбинантного интерлейкина-1 человека:
1. Рекомбинантную плазмидную ДНК pPr-TGATG-hIL-1beta-tsr, обеспечивающую синтез рекомбинантного интерлейкина-1 человека трансформацией вводят в клетки штамма E. Coli С600. Эффективность трансформации клеток E. Coli С600 составляет около 106 клонов на 1 мкг нативной ДНК плазмиды. Трансформанты отбирают на среде, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) после культивирования клеток 24 часа при 28 °С. Из отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК и подтверждают её идентичность препарату ДНК pPr-TGATG-hIL-1beta-tsr с помощью рестриктационного анализа. Получен штамм-продуцент интерлейкина-1 человека – E. Coli ВКПМ-В-5830.
251
2.E. Coli ВКПМ-В-5830 выращивают в течение 14 часов при 28 °С на скошенной агаризованной среде Хоттингера, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Выросшую биомассу смывают питательной средой Хоттингера
ииспользуют в качестве посевного материала.
3.Клетки E. Coli ВКПМ-В-5830 переносят в колбы Эленмейера объемом 750 мл, содержащих 75 мл среды Хоттингера. В среду добавляют 5 г/ л глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Культивирование проводят при перемешивании в течение 6–8 часов при температуре 28 °С. Культивирование прекращают при достижении плотности посевной культуры 2–3 О.Е. при 540 нм.
4.Полученную культуру в количестве 5,0–7,5 % переносят в ферментер объемом 2 л. Для выращивания культуры используют питательную среду следующего состава (г/л): глюкоза – 20,0; MgSO4x7H20 – 0,01; CaCl2 – 0,01; NaCl – 1; бульона Хоттингера до 1 литра; рН среды 6,75–7,0. Ферментер должен быть оснащен системой измерения и регулирования температуры, рН, парциального давления кислорода, скорости вращения мешалки и подачи стерильного воздуха для аэрации. Культивирование проводят при постоянном перемешивании и начальной температуре 28 °С. Оптимальная зона рН для роста клеток 6,7–6,9. При росте в аэробных условиях клетки значительно подкисляют среду. Для стабилизации рН используют 8 %-ый раствор аммиака. Парциальное давление растворенного кислорода поддерживают на уровне 25–30 % путем регулирования скорости вращения мешалки и расхода воздуха в диапазоне 0,5–1,5 объема от объема культуральной жидкости.
5.При достижении оптической плотности культуры около 10 оптических единиц при 540 нм температуру повышают до 42 °С и процесс культивирования продолжают еще 2–3 часа.
6.После завершения ферментации биомассу охлаждают до 8–12 °С, центрифугированием отделяют культуральную жидкость и дрожжевые клетки промывают 0,05 М раствором фосфатного буфера (рН 7,2 – центрифугированием) для удаления остатков культуральной жидкости и
используют для получения интерлейкина-1 .
7. Осадок дрожжевых клеток суспендируют в 0,05 М растворе фосфатного буфера, рН 7,2 и клетки подвергают разрушению (например,
252
ультразвуковой обработкой в ледяной бане или кипячением в течение 2–3 минут в буфере, содержащем 1,0 % додецилсульфата натрия или другими детергентами). Осадок отделяют центрифугированием, а надосадочную жидкость, содержащую интерлейкин, передают на хроматографическую очистку.
8.Для очистки интерлейкина используют различные виды хроматографии: ионно-обменную, гельфильтрацию ВЭЖХ, аффинную хроматографию.
9.Продуктивность штамма составляет не менее 10–12 % рекомби-
нантного интерлейкина-1 от суммарного количества бактериальных белков. Биологическая активность интерлейкина не менее 2 · 108 МЕ на мг препарата. Выход составляет 5–10 мг интерлейкина-1 на 1 грамм массы влажных клеток.
Многие интерлейкины проходят стадию клинического изучения, некоторые другие нашли разнообразное применение в лечении инфекций, воспалительных, аутоиммунных и неопластических расстройств. Так, ин- терлейкин-1β (препарат Беталейкин®) применяют в качестве стимулятора лейкопоэза при токсической лейкопении II–IV степени, осложненной химио- и радиотерапией злокачественных опухолей и как протектор лейкопоэза, при необходимости проведения химиотерапии в условиях лейкопенического фона (число лейкоцитов в крови не менее 3 х 109 на литр). Основным показанием к применению Беталейкина® в качестве иммуностимулятора являются вторичные иммунодефицитные состояния, развивающиеся после тяжелых травм, обширных хирургических вмешательств, в результате гнойно-септических и гнойно-деструктивных процессов, инфекционных заболеваний, а также при хронических септических состояниях.
Интерлейкин-2 включен в схемы иммунохимиотерапии опухолей (меланомы, почечно-клеточного рака, рака мочевого пузыря, колоректального рака), перитонита, панкреатита, в комплексной терапии гнойновоспалительных и инфекционных заболеваний.
В заключение хотелось бы отметить, что цитокины определяют выживаемость клеток, стимуляцию или ингибирование их роста, дифференцировку, функциональную активность и апоптоз клеток.
253
6.3. Биологически активные факторы
6.3.1. Колониестимулирующие факторы
Нейтропения является одним из наиболее серьезных осложнений системной химиотерапии у больных гемобластозами и прямо коррелирует с увеличением риска инфекционных осложнений и смертности от них. В связи с этим особую актуальность приобретает вопрос использования в клинической практике препаратов, позволяющих сократить длительность нейтропении и снизить частоту инфекционных осложнений – рекомби-
нантных колониестимулирующих факторов (КСФ). КСФ – это группа эн-
догенных физиологически активных соединений высокомолекулярной полипептидной структуры, обладающих специфической способностью связываться с рецепторами гемопоэтических клеток и стимулировать их пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность. К настоящему времени выделено более 20 факторов роста гемопоэтических клеток, из которых наиболее изучены гранулоцитарно-макрофагальный КСФ (ГМ-КСФ), гранулоцитарный (Г-КСФ), макрофагальный КСФ, эритропоэтин (см. п. 5.3.) и тромбопоэтин.
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека.
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (Г-КСФ) – гликопротеин с молекулярной массой 19 кDа, продуцируемый моноцитами, фибробластами и эндотелиальными клетками. Он обладает стимулирующим действием на стволовые клетки, регулирует образование функционально активных нейтрофилов, их выход в кровь из костного мозга, а также влияет на некоторые функции зрелых нейтрофилов, включая хемотаксис. Широкий спектр иммунобиологической активности Г-КСФ предопределил его востребованность в медицинской практике, что привело к созданию рекомбинантного препарата. Рекомбинантный человеческий КСФ применяется для лечения онкологических больных, ВИЧинфицированных и людей с врожденной нейтропенией, для коррекции иммунодефицитных состояний, а также для профилактики инфекционных осложнений.
254
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека был впервые выделен в 1985 г. из среды, в которой культивировались клетки карциномы мочевого пузыря. Гены, кодирующие образование КСФ у человека, расположены на длинном плече хромосомы 17 – для Г-КСФ и хромосомы 5 – для ГМ-КСФ. В организме Г-КСФ продуцируются моноцитами, макрофагами, нейтрофилами, фибробластами, клетками стромы костного мозга. Уровень Г-КСФ в физиологических условиях у здоровых людей низкий, однако, он может значительно возрастать при различных патологических состояниях, связанных с потребностью в большем количестве нейтрофилов. Индукторами синтеза Г-КСФ являются некоторые цитокины, такие как фактор некроза опухоли альфа, интерлейкины-1, -17, ингибитором может выступать простагландин Е2. Г-КСФ связываются со специфическими рецепторами, которые имеются на гранулоцитах всех стадий созревания. Рецепторы к Г-КСФ – это протеины, состоящие из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 100–150 кDа. На одной клетке гранулоцитарного ряда имеется от 50 до 100 рецепторов.
В последние годы были созданы и внедрены в медицинскую практику рекомбинантные КСФ. К этим препаратам относятся: ГМ-КСФ – молграмостим, Г-КСФ – филграстим и ленограстим. Молграмостим и филграстим представляют собой негликозилированные белки, продуцируемые генно-модифицированным лабораторным штаммом E. Coli. Ленограстим – гликозилированный Г-КСФ, близкий по структуре эндогенному фактору, получен из культуры клеток яичника китайского хомячка (СНО). Препарат зарегистрирован в Европе и Японии в 1993 году. Использованная технология позволила получать гликозилированный рекомбинантный Г-КСФ человека, идентичный природному Г-КСФ. Однако было показано, что O-гликозилирование придает молекуле Г-КСФ большую стабильность, защищая сульфгидрильную группу цистеина в положении Cys17, хотя в целом не оказывает существенного влияния на его биологическую активность. Поэтому в подавляющем большинстве случаев в настоящее время больных продолжают лечить именно с использованием филграстима.
Филграстим – гликопротеин с молекулярной массой 19 кDа, продуцируемый моноцитами, фибробластами и эндотелиальными клетками. Филграстим представляет собой одну полипептидную цепь, состоящую из
255
175 аминокислотных остатков и содержащую на N-конце неотщепленный метионин. Молекула филграстима, также как и природный Г-КСФ, содержит в положении 17 остаток цистеина со свободной сульфгидрильной группой и две внутримолекулярные дисульфидные связи в положениях Cys36-Cys42 и Cys64-Cys74. Две S-S-связи формируют две малые петли, разделенные 21 аминокислотным остатком. Подобно другим рекомбинантным белкам, которые продуцируются в клетках E. Coli в виде телец включения, филграстиму необходимо пройти процедуру окислительного рефолдинга для восстановления своей биологической активности. Сегодня известны готовые лекарственные формы филграстима: «Нейпоген», Ф. Хоффманн-Ля Рош Лтд, Швейцария; «Граноген», Фармапарк, Россия; «Нейпомакс», Фармстандарт, Россия и др.
Мы рассмотрим основные принципы биотехнологического получения рекомбинантного филграстима по технологии предложенной рос-
сийскими учеными института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова и российской фармацевтической компании ЗАО «Мастерклон».
Рассматриваемый метод включает пять основных стадий: биосинтез, выделение телец включения, ренатурацию белка, ионообменную хроматографию на носителе Sp-Sepharose FF и гель-хроматографию на матрице
Sephadex G-25.
1. Культивирование штамма-продуцента филграстима.
Культуру штамма-продуцента E. Coli BL21(DE3)/pES3-7 выращивали в 250 л питательной среды УТ х 2, содержащей глюкозу (6 г/л), ампициллин (100 мкг/мл) в ферментере объемом 400 л. Культивирование проводили в течение 7–10 часов (рН – 7,0) при температуре 37 °С и перемешивании. Количество посевного материала составляло около 1 % от объема питательной среды (2,5 л). Величину рН во время культивирования корректировали подачей 25 %-ого раствора NH4OH. Аэрация составляла 20 % растворенного кислорода от насыщения путем увеличения скорости перемешивания культуральной жидкости от 250 до 400 об/мин и расхода воздуха от 150 до 250 л/час. В процессе выращивания продуцента оценивали клеточный рост путем измерения оптической плотности культуральной жидкости при длине волны 600 нм. При достижении оптической плотности
256
2,8–3,2 ОЕ индуцировали экспрессию рекомбинантного белка добавлением в культуральную жидкость изопропил- -D-тиогалактозида. После индукции происходил синтез рекомбинантного белка, который накапливался в клетках в виде телец включения. Через 3 часа культивирования в качестве индуктора в ростовую среду добавляли изопропил- -D-тиогалактозид до конечной концентрации 0,25 мМ. Культивирование продолжали еще 2–3 часа. Затем клетки, содержащие тельца включения центрифугировали при 16000 об/мин и скорости подачи культуральной жидкости в ротор центрифуги 3–4 литра в минуту.
2. Выделение телец включения.
Клетки, содержащие тельца включения после центрифугирования, суспендировали в буферном растворе (2М мочевина, 50 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-НCl, рН 8,0) в соотношении 1 : 10 (масса/объем) и разрушали в проточном дезинтеграторе при давлении 600 бар. После дезинтеграции клеточную суспензию центрифугировали на проточной центрифуге при 16000 об/мин и скорости подачи суспензии в ротор центрифуги 1 литр в минуту. Тельца включения дважды отмывали от соосаждаемых клеточных компонентов в буферном растворе (50 мМ трис-НCl, рН 8,0) в соотношении тельца включения/ буферный раствор 1 : 10 (масса/объем). Отмытые тельца включения выделяли на проточной центрифуге при 16000 об/мин и скорости подачи суспензии в ротор центрифуги 1 литр в минуту. Содержание рекомбинантного белка в суммарном клеточном лизате и чистоту телец включения анализировали с помощью электрофореза в ПААГ. Из 1 литра питательной среды получали 1,2 ± 0,1 г телец включения, содержащие по данным электрофореза 58–62 % целевого белка.
3. Ренатурация.
3.1. Для солюбилизации белков, экспрессированных в тельцах включения, применяют буферные растворы, содержащие хаотропные агенты, такие как мочевина, гуанидин гидрохлорид, додецилсульфонат натрия и другие детергенты. Так как гуанидин гидрохлорид детергенты затрудняют процесс очистки, в качестве солюбилизирующего агента была выбрана мочевина. Оптимизацию условий солюбилизации проводили по двум параметрам: рН и концентрация мочевины. Авторами установлено, что при высоких значениях рН (более 11,0) увеличивается выход белка из телец
257