Материал: Фарм производство БАР

Интересен способ получения НМГ на основе предварительной

щения при 20 °С равной 28 °–55 °; анти-Ха – 163 МЕ/мг и анти-IIа –

ультрафильтрации НФГ с целью их освобождения от фракций с молеку-

53 МЕ/мг.

лярной массой менее 3 кDа и проведения деполимеризации и фракциони-

Достаточно часто используют метод деполимеризации с применени-

рования за счет различного растворения продуктов в водной и органиче-

ем азотной кислоты. НФГ, полученный из слизистой кишечника свиньи

ской фазах. Несмотря на то, что гепарин не растворим в органических рас-

растворяю в очищенной воде до конечной концентрации 5,0 %. К раствору

творителях, его комплексы с катионами четвертичного аммония при опре-

НФГ прибавляют натрия нитрат до конечной концентрации 0,01М. Смесь

деленных условиях растворимы в дихлорметане. Для деполимеризации ис-

доводят до температуры 18–24 °С и в течение двух минут прибавляют

пользовались коммерческие препараты НФГ с молекулярной массой

37 %-ый раствор хлористоводородной кислоты до значения рН = 3,2. Рас-

17 кDа, выделенные из слизистой оболочки свиньи. Гепарин натрия рас-

твор перемешивают в течение двух часов при указанной температуре. По-

творяют в воде и проводят ультрафильтрацию на полых волокнах до пол-

сле двух часовой инкубации при помощи 50 % раствора натрия гидроокиси

ного удаления фракций с молекулярными массами менее 3 кDа. К концен-

устанавливают значение рН = 6,75. Затем проводят процесс ультрафиль-

трированному раствору до половины исходного объема прибавляют

трации через мембраны с порогом отсечения 10 кDa и диализ против воды

натрия хлорида и 7,5 % раствор бензетония хлорида в дихлорметане. Рас-

очищенной. Получены НМГ с выходом 42,0 %.

твор смешивают с водным 0,17 М раствором натрия хлорида. Затем к сме-

Описан метод деполимеризации НФГ путем термической обработ-

си при температуре 20–25 °С прибавляют хлористый бензил. Смесь пере-

ки. НФГ натрия растворяют в воде в соотношении 1 : 5, охлаждают до

мешивают при указанной температуре в течение 6 часов. Затем к смеси

5–10 °С. Добавляют катионит до снижения значения рН до 3,5 для получе-

прибавляют бензилтриметиламмония гидроксид и продолжают перемеши-

ния гепариновой кислоты. Смола удаляется центрифугированием. К рас-

вание в течение 3-х часов. После окончания перемешивания к раствору

твору прибавляют перекись водорода до конечной концентрации около

бензилгепаринат прибавляют 2 N раствор натрия гидроксида и выдержи-

3,5 %. После чего незамедлительно подвергают автоклавированию при

вают в течение 2-х часов при 4 °С. Реакция деполимеризации прекращает-

125 °С в течение 10 минут. Раствор охлаждают, доводят рН до значения 6,8

ся добавлением 1 N хлористоводородной кислоты. Полученный продукт

при помощи гидроокиси натрия. НМГ осаждают добавлением этилового

подвергают ультрафильтрации на мембранах с порогом отсечения 1 кDа

спирта до конечной концентрации 50,0 %. Осадок отделяют центрифуги-

для удаления хлорид-ионов, а затем продукт лиофилизируют. На этом эта-

рованием и сушат в вакууме. Средняя молекулярная масса НМГ около

пе, возможно, олигосахариды можно выделить из водного раствора оса-

5 кDа.

ждением НМГ метанолом, ацетоном, этанолом в виде натриевой соли.

Авторы предлагают ознакомиться с технологией получения НМГ

Необходимо отметить, что ультрафильтрация является методом очистки

Эноксапарина, который сегодня широко применяется в Украине.

гепаринов от различных низкомолекулярных примесей, включая целена-

1. Предварительная стадия. Субстанцию гепарина натрия раство-

правленное концентрирование активных фракций вещества. Комбинации

ряют в очищенной воде, охлаждают до температуры 4–8 °С и добавляют

ультра- и диафильтрации дают возможность с выходом 90 % проводить

охлажденный этанол. Смесь выдерживают при температуре 4–8 °С в тече-

десятикратное концентрирование растворов гепарина. Этот метод исполь-

ние 10–12 часов для формирования осадка. Осадок отделяют центрифуги-

зуется большинством авторов, работающих в области выделения гетеропо-

рованием или фильтрацией и высушивают. Аликвоту осадка (3 % граммов)

лисахаридов из экстрактов животных тканей, в том числе и очистки НМГ.

обработанного таким образом гепарина используют в качестве образца для

Полученный продукт характеризовался молекулярной массой 3,0–7,0 кDа;

определения деполимеризации путем добавления к растворенному в воде

средней молекулярной массой – 3,8 кDа; содержанием: уроновой кислоты

очищенному образцу азотной кислоты. Степень деполимеризации опреде-

(25–40 %), серы (10–13 %), азота (1,8–2,5 %); величиной оптического вра-

ляют исследованием материала методом высокоэффективной жидкост-

ной хроматографии (эксклюзионной хроматографии). Полученное таким

88

89

Технология получения НМГ сводится к трем стадиям:

Деполимеризации можно добиться также использованием высоких

1. Деполимеризация НФГ и фракционирование этанолом. Гепарин

энергий излучения, например, γ-излучением в присутствии органических

натрия, полученный из мукозы свиньи, растворяют в очищенной воде до

растворителей. В качестве растворителей использовали спирты (изопропи-

конечной концентрации около 10 %. С помощью концентрированной хло-

ловый, этиловый, метиловый и др.); эфиры (диоксан, тетрагидрофуран и

ристоводородной кислоты устанавливают рН раствора до значения 2,5.

др.); альдегиды (формальдегид, ацетальальдегид и др.). Использовали

Деполимеризацию проводят под постоянным контролем. При помощи

γ-излучение 60Сo. НФГ с молекулярной массой 14,8 кDа растворяли в ди-

натрия гидроксида устанавливают значение рН = 10,0 и к раствору прибав-

стиллированной воде, содержащей, например, 0,5 % изопропилового спир-

ляют натрия боргидрида (NaBH4). Смесь перемешивают в течение 15 ча-

та. Раствор помещали в сосуд из стекла Pyrex, используя энергию в

сов, а затем с помощью концентрированной хлористоводородной кислоты

150 KGy. Получен раствор темно-желтого цвета. Для обесцвечивания рас-

величину рН устанавливают на уровне 3,5–4,0 для разрушения избытка

твора значение рН при помощи 32 % раствора натрия гидроксида доводили

боргидрата натрия. Затем с помощью натрия гидроксида доводят значение

до 8,0–8,5 и перемешивали в течение 7 часов. Затем при помощи раствора

рН до 7,0. К раствору прибавляют два объема этилового спирта для оса-

10 % хлористоводородной кислоты значение рН доводили до 6,5, обраба-

ждения целевого продукта. Осадок отделяют и растворяют в воде очищен-

тывали ацетоном, и полученный порошок высушивали в вакууме при тем-

ной и прибавляют натрия хлорид до определенной величины ионной силы,

пературе не выше 60 °С. Получен НМГ со следующими характеристиками:

определяемой кондуктометрически. В растворе с помощью хлористоводо-

средняя молекулярная масса – 4,89 кDа; уроновых кислот – 28,2 %; рН 4,8–

родной кислоты устанавливают рН = 4,0 и добавляют для осаждения гепа-

5,5; органических сульфатов – 12,2 %; активность анти-Ха – 104 МЕ/мг.

рина один объем этилового спирта. Для формирования осадка гепаринов

Также установлено, что облучение необходимо проводить ступенчато т.к.

смесь выдерживают около 60 часов и спиртово-водный слой удаляют. По-

при однократном облучении не полностью деполимеризуется НФГ. По

лученный осадок НМГ (надропарин) находится в натриевой форме. Осадок

мнению авторов необходимо, по крайней мере, два этапа облучения, при

растворяют в воде очищенной до концентрации приблизительно 18 % и

этом на последующих этапах при облучении γ-лучами происходит полная

устанавливают значение рН = 7,0 при помощи раствора натрия гидрооки-

деполимеризация гепарина. Предложено несколько источников получения

си. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через картридж с раз-

γ-излучения – 137Cs, 226Ra, 60Co. Обработку материала излучением предла-

мером пор 0,2 мкм.

гают проводить в атмосфере азота при 100–200 KGy.

2. Обработка полученных продуктов в ультрафиолете. Исследова-

3. Хроматографическая очистка и перевод в кальциевую соль. Рас-

ния физико-химических и биологических свойств полученных препаратов

твор надропарина натрия подвергают анионообменной хроматографии. В

убедительно показало, что обработка ультрафиолетом не приводит к изме-

собранные фракции очищенного НМГ прибавляют натрия хлорид и оса-

нению свойств надропарина и к его деградации. Средняя молекуляр-

ждают 1,5 объемами этилового спирта. Смесь выдерживают около 41 часа

ная масса препарата около 5 кDа. Активность против факторов:

и супернатант отделяют. Осадок гепарина растворяют в воде очищенной

Ха – 124 МЕ/мг и IIа – 30 МЕ/мг.

до концентрации приблизительно 18 % и прибавляют гексагидрат кальция

На этой стадии проводят обработку ультрафиолетом при длине вол-

хлористого и перемешивают. К смеси прибавляют 1,5 объема этилового

ны 254 нм в течение 9–10 минут со скоростью 4,8 литра в час при комнат-

спирта и выпавший осадок отделяют и сушат при температуре не более

ной температуре и рН раствора около 7,0. Раствор вводится в специальную

60 °С.

систему облучения и с помощью перистальтического насоса циркулирует

Интерес представляют данные, полученные при выделении гепари-

со скоростью 19 л/час в течение 16 часов при температуре 30 °С.

нов при помощи аффинной хроматографии. В качестве сорбента исполь-

92

93