ный и более равномерный, чем у НФГ. Это объясняется тем, что НМГ значительно хуже связываются с эндотелиальными клетками и белками плазмы крови. Выведение почками является основным путем элиминации НМГ. При почечной недостаточности Т½ НМГ значительно увеличивается. НМГ в значительно меньшей степени, чем НФГ, связываются с белками плазмы (например, гликопротеидом, богатым гистидином, фактором 4 тромбоцитов и т.д.), которые способны нейтрализовать их антикоагулянтную активность. НМГ более резистентны к тромбоцитарному фактору 4, освобождаемому из тромбоцитов при их активации. Именно низким сродством НМГ к гепарин-нейтрализующим белкам плазмы можно объяснить высокую биодоступность при их применении в низких дозах. Все указанные особенности фармакокинетики и фармакодинамики НМГ обуславливают их несомненное преимущество. Другое преимущество НМГ перед НФГ низкая частота развития тромбоцитопении. Частота тромбоцито-
пении при лечении НФГ колеблется от 1 до 3 %. Тромбоцитопения чаще встречается при лечении препаратами гепаринов, полученных из легких крупного рогатого скота (15,6 %), чем при лечении гепаринами, выделенными из слизистой оболочки кишечника (5,8 %). Использование эноксапарина натрия (Клексана) – эффективный способ предупреждения тромбоэмболических осложнений у больных онкоторакального профиля при проведении комплексного лечения. Применение этого препарата не увеличивает объем интра- и послеоперационной кровопотери при онкоторакальных вмешательствах, включая расширенные операции и медиастинальную лимфодиссекцию, способствует сокращению продолжительности лимфореи и сопровождается уменьшением количества пневмоний, развивающихся на фоне индукционной полихимиотерапии и в послеоперационный период.
Антитромботические средства применяют при беременности для лечения и профилактики венозной тромбоэмболической болезни, эмболий, связанных с клапанными пороками сердца или возникающих после протезирования клапанов, для предотвращения задержки развития плода и его потери у женщин с антифосфолипидным синдромом, а также при тромбофилических состояниях. Применяли следующие НМГ: надропарин (Фраксипарин) – 208 случаев, эноксапарин (Клексан) – 137, дальтепарин (Фрагмин) – 59, ревипарин (Кливарин) – 43, тинзапарин (Инногеп) – 19. Дли-
108
тельное применение НМГ в сравнении с использованием НФГ значительно реже приводит к осложнениям, в том числе остеопорозу, тромбоцитопении, кровоточивости. В целом на основании проведенного анализа авторы утверждают, что применение НМГ во время беременности безопасно как для плода, так и матери и позволяет предупредить ряд осложнений.
Тромбоз глубоких вен и тромбоэмболия легочной артерии являются главной причиной осложнений и смертности у пациентов с травмами. Крупномасштабные исследования в элективной ортопедической хирургии показали эффективность и безопасность применения НМГ для профилак-
тики тромбоза глубоких вен. Было проведено рандомизированное, открытое многоцентровое исследование. В исследование были включены пациенты с переломами позвоночника, костей таза и нижних конечностей. Показано, что профилактика тромбоза глубоких вен и тромбоэмболии легочной артерии НМГ (надропарином кальция) у больных с ортопедической травмой один раз в день в фиксированной дозе так же эффективна, как и в дозе, рассчитанной в соответствии с массой тела пациента. Частота возникновения массивных кровотечений и низкая тромбоцитопения, индуцированная НМГ, свидетельствует о безопасности применения НМГ у пациентов с ортопедической травмой.
Продемонстрирована высокая клиническая эффективность при использовании НМГ в нефрологии при хронических заболеваниях почек. Та-
ким образом, НМГ так же как НФГ являются катализаторами антитромбина III. Однако благодаря уменьшению количества мукополисахаридных цепей и соответственно уменьшению молекулярной массы их антитромбическое действие более селективно и поэтому более предсказуемо, чем у НФГ, и главным образом, заключается в инактивации фактора Ха. В меньшей степени НМГ влияют на фактор IIа, что уменьшает риск выраженных кровотечений, которые, в принципе, могут возникать на фоне любой антитромботической терапии. НМГ не связываются с эндотелием и обладают меньшей способностью связываться с белками плазмы. Это обуславливает большую биодоступность, значительное увеличение времени полувыведения и стабильный дозозависимый эффект при подкожном введении.
Основными нежелательными эффектами НМГ являются кровоте-
чения, тромбоцитопения и остеопороз. К редким нежелательным реакциям относят гипоальдостеронизм, преходящее повышение сывороточной ак-
109
тивности аминотрансфераз и уровня свободных жирных кислот, аллергические кожные реакции и некроз кожи при подкожном применении. В контролируемых клинических исследованиях частота геморрагических осложнений при применении НМГ была в целом сопоставимой с таковой при лечении НФГ или ниже. Для купирования кровотечений, вызванных НМГ, может быть использован протамин, хотя он нейтрализует их активность менее эффективно, чем активность НФГ. Серьезным нежелательным эффектом НФГ является тромбоцитопения, которая развивается у 1– 3 % больных и может привести к серьезным осложнениям. При лечении НМГ частота тромбоцитопении ниже, чем при использовании НФГ. При появлении тромбоцитопении на фоне введения НФГ его не следует менять на НМГ, учитывая высокую частоту перекрестной их реактивности с гепа- рин-зависимыми антителами. Остеопороз развивается при длительном применении НФГ, особенно при беременности. Случаи его описаны и при лечении НМГ, хотя препараты этой группы реже вызывают развитие остеопороза. Частота аллергических кожных реакций при лечении НМГ низкая, хотя возможно её до сих пор несколько недооценивают. Аллергические реакции включают в себя крапивницу, эритему, некроз кожи, нередко сочетающийся с тромбоцитопенией.
НМГ различаются по способу производства, молекулярной массе и активности. В связи с этим не рекомендуется в ходе лечения заменять один препарат на другой.
Таким образом, проанализировав данные о побочном действии НМГ, зарегистрированных сегодня в Украине, мы можем отметить следующее:
кровотечения в разных местах более частые у больных с другими факторами риска;
описаны спорадические случаи тромбоцитопений, иногда тромбообразующих;
кожные реакции;
описаны отдельные случаи кожного некроза, обычно возникающие в месте введения, при применении стандартного гепарина и НМГ;
небольшие гематомы в месте введения;
обратимая эозинофилия;
генерализованные реакции повышенной чувствительности, включая отек кровеносных сосудов;
повышенный уровень трансаминаз;
110
описаны редкие случаи гематомы спинного мозга при использовании эноксапарина натрия на фоне спинальной анестезии с развитием стойкого или необратимого паралича. Риск этого осложнения выше при использовании катетеров после операции.
Суммируя изложенное, можно заключить, что в настоящее время большинство исследователей считают, что НМГ по силе действия не уступают НФГ. В то же время, препараты НМГ имеют ряд преимуществ, в том числе, они приводят к значительно меньшему количеству осложнений.
3.4. Контроль и стандартизация гепаринов
Требования к качеству НМГ изложены в Государственной Фармакопее Украины и Европейской фармакопеи. В соответствии с требованиями фармакопей НМГ представляют собой соли сульфатированных глюкозаминогликанов со средней молекулярной массой меньше 8,0 кDа, которой должно быть не менее 60 % общей массы. НМГ имеют разную химическую структуру на концах полисахаридных цепочек.
Контроль осуществляют по следующим характеристикам:
идентификация: А – ядерномагнитный резонанс (в сравнении с соответствующим стандартным образцом); В – определение отношения активности антифактора Ха к активности антифактора IIа (не менее 1,5);
С– эксклюзивная хроматография (молекулярные массы должны соответствовать препарату сравнения производителя); D – субстанция должна давать реакции либо на натрий, либо на кальций;
испытания на чистоту: рН – от 5,5 до 8,0; азот – от 1,5 до 2,5 %;
кальций – от 9,5 до 11,5 % (для гепарина кальция); натрий – от 9,5 до 12,5 % (для гепарина натрия);
молярное соотношение сульфат ионов к карбоксилат ионам – не менее 1,8;
тяжелые металлы – не более 0,003 %;
потеря в массе при высушивании – не более 10,0 %;
бактериальные эндотоксины – менее 0,01 МЕ/МЕ анти-Ха актив-
ности;
количественное определение – активность не менее 70 МЕ актив-
ности анти-фактора Ха (также проводят определение активности к антифактору IIа).
111
Проанализировав указанные тесты, мы не обнаружили методов, позволяющих оценить присутствие в препаратах гепарина гиперсульфатированного хондроитин сульфата и дерматан сульфата. В то же время, именно с одним из этих компонентов (гиперсульфатированным хондроитин сульфатом) связывают серьезные побочные эффекты. В настоящее время, в России предложено всем производителям ввести в нормативную документацию тестирование субстанций по данному продукту. В качестве метода предлагается капиллярный электрофорез в свободном растворе (зональный капиллярный электрофорез). На электрофореграмме тестируемого раствора не должен присутствовать остроконечный пик гиперсульфатированного хондроитин сульфата перед пиком гепарина. Допускается наличие пика дерматан сульфата после пика гепарина. Также предлагается проведение ЯМР спектроскопии в диапазоне 1,5–2,5 м.д.; не допускается присутствие характерного для гиперсульфатированного хондроитин сульфата сигнала при м.д. Необходимо отметить, что ряд производителей вводят дополнительные тесты, например, содержание дерматан сульфата не более 0,9 % (Shenzhen Hepflink (TONGDA) Biological Technology Co. LTD). Кроме того,
обязательным является определение: остаточных органических растворителей, используемых при производстве (ацетона, этанола, метанола и др.); микробиологической чистоты; специфического оптического вращения (не менее чем 35 °). Возможно применение масс-спектроскопии для получения информации о структурной организации гликозаминогликанов. В Европейской фармакопее представлена монография «Надропарин кальция». Для идентификации субстанции необходимо определять фракционный состав и анти-фактор Ха активность. Фракционный состав предлагается определять методом ВЭЖХ с рефрактометрическим детектором; анти-фактор Ха с помощью реактивов для спектрофотометрического определения.
Заключение
Хотелось бы отметить, что НМГ (Дальтепарин, Эноксапарин, Надропарин и др.) существенно различаются между собой по фармакодинамике влияния на каскад свертывания и фармакокинетическим характеристикам. Анализ литературы позволяет нам рассматривать НМГ как различные препараты, каждый из которых характеризуется собственным профилем эффективности и безопасности. Таким образом, даже препараты с близким
112
составом по молекулярным массам все же отличаются один от другого и по разному влияют на систему свертывания крови. Все НМГ отличаются между собой средней молекулярной массой, её распределением и биологической активностью in vitro и in vivo. НМГ более длительный период циркулируют в крови, значительно дольше инактивируют (на фосфолипидных мембранах) фактор Ха (не снижая его синтез), минимально ингибируют тромбин. Высокое родство НМГ к антитромбину III, их пролонгированная антитромбиновая активность дают возможность использовать меньшие суточные дозы, при однократном подкожном введении надежно предотвращать тромбоэмболии, в том числе и послеоперационные. После подкожного введения НМГ полностью адсорбируются и длительность полувыведения их анти-Ха активности почти в два раза больше, чем НФГ. В то же время, период элиминации анти-IIа активности такой же, как у НФГ. Биодоступность НМГ достигает 90 %. Даже при низких дозах доступность НМГ выше, чем у НФГ. Последнее связано с низкой аффинностью НМГ к эндотелию, белкам плазмы, внеклеточному матриксу, а также к 4 фактору тромбоцитов, которые нейтрализуют антикоагулянтный эффект НФГ. НМГ усиливают фибринолиз: они высвобождают из эндотелия сосудов эндогенные антитромботические вещества и активаторы плазминогена, непосредственно повышают антитромботический потенциал стенок сосудов и опосредовано стимулируют выделение антитромботических гликозаминогликанов и простациклинов – эффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов и вазодилаторов, которые являются существенным компонентом антикоагулянтной активности этих гепаринов. Одним из важнейших факторов для более широкого использования НМГ является экономия средств для лечения больных. Так, по данным ряда исследователей, учитывая, что терапевтический эффект наблюдается при приеме НМГ 1 раз в сутки, стоимость лечения практически в два раза ниже, чем при использовании НФГ. В отличие от НФГ различные препараты НМГ могут быть дифференцированы по биологическим и клиническим признакам. НМГ рассматриваются специалистами как различные лекарственные средства, требующие определения дозировки и спецификаций для каждого продукта. Различия между НМГ обусловлены их молекулярными и структурными свойствами. В зависимости от метода деполимеризации: химическая (Эноксапарин), ферментативная (Тинзапарин), обработка азотистой кислотой (Дальтепарин), окислением (Ардепарин) мы сталкиваемся с различны-
113
ми по составу и свойствам препаратами. В каждом препарате установлено различное соотношение отдельных цепей гепарина, обуславливающее различные молекулярные массы. Любые минимальные изменения технологического процесса могут изменять ряд свойств препаратов НМГ: плотность заряда, формирование ангидро-манно или ангидро-глюко группировок, различное содержание сульфо- и ацетилгрупп. Так, например, для Эноксапарина около 30 % молекул не охарактеризованы путем прямого анализа. Таким образом, существует вероятность, что могут быть определенные различия между различными препаратами НМГ.
В то же время при клиническом применении НМГ существует проблема правильного подбора препарата и его вводимой дозы, что вызвано отличающимися свойствами гепарина из-за различной специфичности, молекулярной массы, различного состава и наличия сопутствующих примесей. По нашему мнению, необходимо в субстанциях препаратов определять содержание каждой молекулярной фракции. При средней молекулярной массе от 3,8 до 5,0 кDа, по-видимому, необходимо определять содержание именно этого компонента. Кроме того, необходим контроль препаратов по другим примесным компонентам: xондроитинсульфату (присутствие в препаратах хондроитинсульфата может приводить к реакциям анафилактического типа), гиперсульфатированному хондроитинсульфату, дерматан сульфату и др. Учитывая, что соотношение антифактора Ха к антифактору IIа даже в пределах одного продукта широко варьирует (так, для надропарина кальция это соотношение колеблется от 2,5 до 4,0) необходимо стандартизовать продукт по этому показателю. Используемые сегодня НМГ должны рассматриваться как оригинальные, а не генерические препараты (непатентованные лекарственные препараты, являющиеся воспроизведением оригинального препарата, на действующее вещество которого истёк срок патентной защиты, могут отличаться от оригинального препарата по составу вспомогательных веществ), отличающиеся по способам получения, составу и клиническому действию. Все это требует проведения соответствующих исследований по изучению их физико-химических, биологических и клинических свойств. Перспективы у тех производителей НМГ, которые сумеют своевременно дополнить требования фармакопеи методами анализа, позволяющими стандартизовать препараты низкомолекулярных гепаринов с целью снижения побочного действия.
114
Контрольные вопросы
1.Какой механизм действия характерен для гепарина?
2.Классификация гепаринов по спектру действия и химической структуре.
3.Какими свойствами обладает нефракционированный гепарин?
4.В чем преимущества низкомолекулярного гепарина?
5.Какими методами определяют биологическую активность гепари-
нов?
6.Каковы основные методы применяют для получения низкомолекулярных гепаринов?
7.Охарактеризуйте основные технологические этапы получения гепаринов и методы их очистки.
8.Какие ферменты используются для получения низкомолекулярных гепаринов?
9.Схема производства эноксапарина натрия.
10.Каким образом влияют примеси низкомолекулярных гепаринов на их фармакологическую активность?
11.Описать сырьевые источники для получения различных видов гепаринов.
12.С какой целью при получении низкомолекулярных гепаринов используется ультрафильтрация?
13.Привести основные фармакопейные требования к низкомолекулярным гепаринам.
14.Физико-химические и фармакологические свойства гепаринов.
15.Какие основные лекарственные формы гепаринов?
16.Какие методы применяют для характеристики гепаринов?
17.Какова роль гепаринов в системе свертывания крови?
18.Чем объясняется необходимость в препаратах гепарина?
19.При каких патологических состояниях применяют гепарин?
115
ГЛАВА 4. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ВИТАМИНОВ
Витамины – низкомолекулярные органические вещества разнообразной химической структуры, которые являются биологическими катализаторами химических реакций проходящих в живой клетке, необходимы для нормального обмена веществ и жизнедеятельности организма. Термин витамины предложил в 1911–1912 году польский ученый К. Функ. Многие витамины – это предшественники коферментов, берущих участие в ферментативных реакциях. Сегодня известно около 30 витаминов и витамино-
подобных соединений. По физико-химическим свойствам витамины раз-
деляют на водорастворимые (В1 – тиамин, В2 – рибофлавин, В5 – пантотеновая кислота, В6 – пиридоксин, В12 – кобаламин, РР – никотиновая кислота, Н – биотин, фолиевая кислота, С – аскорбиновая кислота, Р – рутин) и жирорастворимые (А – ретинол, D – кальциферол, E – токоферол, витамин К).
Человек и животные получают большинство витаминов с пищей. В ряде случаев с продуктами питания в организм попадают не витамины, а вещества близкие к ним по строению, так называемые, провитамины (предшественники витаминов), которые в организме превращаются в витамины. Кроме того, ряд витаминов синтезируется микрофлорой кишечника человека и животных.
Недостача или отсутствие витаминов приводит к тяжелым заболеваниям (цинга, рахит, куриная слепота, полиневрит и др.). Витаминная недостаточность (гиповитаминоз) – патологическое состояние, обусловленное недостатком в организме отдельного витамина или комплекса витаминов, что сопровождается нарушениями биохимических и физиологических процессов и возникновением специфической патологии. Основными причинами гиповитаминоза является: уменьшение поступления определенного витамина в организм в составе продуктов питания (экзогенные гиповитаминозы); нарушения при усвоении определенных витаминов клетками организма, вследствие снижения их всасывания в пищеварительном тракте
116
или неспособности биохимических систем организма включать витамины в обменные процессы (эндогенные гиповитаминозы); увеличение выведения витамина из организма или повышенная его утилизация в биохимических или физиологических процессах (в период кормления грудью, беременности, тяжелых инфекционных болезнях, при экстремальных температурах и тяжелой физической работе).
Избыток витаминов (гипервитаминоз) наблюдается при чрезмерном поступлении витаминов в организм. Наблюдается, например, при приеме высоких доз жирорастворимых витаминов, которые характеризуются выраженной липофильностью и способны задерживаться в организме. Так, гипервитаминоз витамина D может развиваться при увеличенном потреблении печени и жира некоторых морских рыб, а также у детей при передозировке витамина D в процессе лечения рахита. При гипервитаминозе витамина D возникает гиперкальциемия и гиперфосфатемия вследствие деминерализации костной ткани, активации процессов всасывания Са2+ в кишечнике и реабсорбции в почках.
Наука о витаминах развивается более 130 лет с конца XIX века:
1881 г. – русский ученый Лунин Н. И. провел эксперименты с пищевыми веществами: извлекал белки, жиры, углеводы и минеральные соли из молока и кормил этой смесью лабораторных мышей. Животные болели
иумирали. Луниным Н. И. был сделан вывод о том, что для удовлетворения потребностей организма животных, кроме указанных веществ, необходимы и другие вещества;
1911 г. – английский ученый Хопкинс Ф. Г. расширив эксперименты Лунина Н. И. и проведя анализ проведенных результатов, выступил с теорией о «дополнительных» питательных веществах, необходимых организму для нормального развития;
1911 г. – польский ученый К. Функ, работающий в Лондоне, опубликовал результат своих исследований экстрактов из семян риса. Выделив вещество в кристаллическом состоянии, он назвал его «витамином» (vita (жизнь) + aminus – т.е. азотосодержащие вещества, необходимые для жизни). К. Функ ввел новое понятие – авитаминоз;
117