Материал: Фарм производство БАР

ДНК. АДФ-рибозилирующие экзотоксины, вводимые совместно с ДНК и наносимые на кожу, могут стимулировать чрезкожную иммунизацию. Существуют данные о возможности «выстреливать» ДНК-вакцину, упакованную в липосомы. Облегчение воздействия может происходить на уровне клеточного всасывания, экспрессии или иммунологической активации.

Бактерии, реплицирующиеся внутриклеточно, можно подвергнуть генно-инженерной обработке с целью доставки плазмидной ДНК в клетки для экспрессии рекомбинантных белков. S. flexneri был аттенуирован путем создания делеционного мутанта по жизненно важному гену (asd). Хотя такой штамм может размножаться in vitro при наличии диаминопимелиновой кислоты (DAP) и может оккупировать клетки, он не способен размножаться in vivo, при отсутствии DAP. Этот штамм был трансформирован плазмидой, несущей эукариотический промотор и рекомбинантный ген. Полученный рекомбинантный штамм S. flexneri strain оказался способным заселять клетки млекопитающих in vitro и экспрессировать белок, кодируемый плазмидой, в качестве потенциального вакцинного антигена. Поскольку S. flexneri реплицируется в кишечнике и стимулирует иммунитет слизистых оболочек, данный вектор можно вводить пероральным путем с целью доставки ДНК к клеткам, в которых стимулируется иммунитет слизистых оболочек. Другие аттенуированные штаммы различных видов бактерий (например, Salmonella, способный к заселению клеток млекопитающих, но не к делению), также могут доставлять рекомбинантные плазмиды пероральным путем для экспрессии рекомбинантных белков в качестве вакцинных антигенов.

При введении ДНК-вакцины активизируются клетки иммунной системы: В-лимфоциты вырабатывают антитела, нейтрализующие антигены в жидких межклеточных тканях (гуморальный иммунный ответ), а цитотоксические Т-лимфоциты разрушают бактерии и вирусы внутри клеток (клеточный иммунный ответ). Получены экспериментальные данные, что один и тот же антиген, введенный в организм обычным методом и с помощью ДНК-вакцины, продуцирует разные варианты иммунного ответа. При ДНК-вакцинации синтезируются иммуноглобулины – IgG2a (максимум через 6 недель), а при традиционном введении IgG1 (через 1–2 недели). При ДНК-вакцинации Т-хелперы животных секретируют интерферон-γ, а после обычной вакцинации – интерлейкины ИЛ-4 и ИЛ-5. Таким образом,

218

использование ДНК-вакцины приводит к так называемому Т-хелперному ответу (Th-1), а обычная вакцинация – к Th-2. Интерес к ДНК-вакцинам стимулируется рядом свойств, которыми они обладают. Используя один и тот же плазмидный или вирусный вектор можно создавать вакцины против различных инфекционных заболеваний, меняя только последовательность, кодирующую необходимые антигены. В то же время, по мнению ряда исследователей, прямая инокуляция плазмидной ДНК должна приводить к синтезу белков in vivo, конформационная и посттрансляционная модификация которых идентична синтезируемым при инфекционном процессе заражения вирусом.

Преимуществом ДНК-вакцин являются: отсутствие специальных методов доставки и высокая стабильность (ДНК-вакцины стабильны даже при комнатной температуре), высокая степень очистки, отсутствие балластных белков и контаминации посторонними агентами и индуцирование у животных системного и местного иммунитета. Двукратная внутримышечная вакцинация собак плазмидной ДНК, экспрессирующей гликопротеин вируса бешенства защищает животных от контрольного заражения вирулентным штаммом вируса бешенства. Уже разработаны и проходят испытания ДНК-вакцины против инфекций, вызываемых вирусами гепатита В и С, гриппа, лимфоцитарного хориоменингита, бешенства, японского энцефалита, туберкулеза, лейшманиоза, малярии и др. Нужный ген, вставляют в плазмиду или безопасный вирус. Такой носитель-вектор проникает в клетку и синтезирует нужные белки, обладающие протективным действием. Для внедрения этих вакцин в медицинскую практику требуется решение еще очень многих вопросов. Например, генами кодируются белковые антигены, и пока нет альтернативы полисахаридным антигенам, входящим в состав ряда традиционных вакцин. Несомненно, важным является разработка методов получения и очистки плазмидной ДНК, освобождение от балластных примесей бактериального происхождения, хромосомной ДНК и примесей РНК. Самостоятельным вопросом является подбор для ДНК-вакцин адъювантов и носителей. Обращает на себя внимание вопрос о судьбе введенной в клетку ДНК. На сегодняшний день нет однозначного ответа. ДНК может интегрировать в геном хозяина с весьма серьезными последствиями, если при этом происходит злокачественная трансформация клеток или затрагивается какой-то важный ген, что приводит к мутагенно-

219

му эффекту. По мнению многих исследователей, такое развитие событий считается крайне маловероятным. По их мнению, такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицирующегося внехромосомного элемента, а затем разрушится. По нашему мнению эти вопросы еще недостаточно изучены и внедрение ДНК-вакцин в медицинскую практику требует всестороннего изучения, а именно: судьба введенной ДНК-вакцины; длительность экспрессии антигена; безвредность ДНК-вакцин; образование антител к самой ДНК и примесям вакцины и т.п.

Таким образом, было показано, что после того, как клетки in vivo принимают ДНК, кодирующую вакцинные антигены, они могут секретироваться или связываться с клеточной поверхностью таким способом, который будет запускать гуморальный или клеточный иммунный ответ. Более того, поглощение ДНК можно усилить химическим путем или при использовании для доставки вирусов или бактерий. Последние подходы соответствуют определению вакцины на основе ДНК как неспособной реплицироваться в организме человека. Недавно начали проходить клинические испытания вакцины ДНК без оболочки, усовершенствованные и вводимые при помощи вирусов. Несмотря на то, что ДНК-вакцины разрабатываются более 20 лет, ни одна из таких вакцин до сих пор не разрешена к применению.

6.1.8. Разработка состава вакцин

Иммунологическая эффективность вакцин (кроме живых) может повышаться путем подбора состава, что касается окончательной формы вакцины, которая должна вводиться in vivo. В дополнение к «активному веществу» (антиген или ДНК), состав может включать в себя адъювант и / или систему доставки в дополнение к наполнителям. Адъювант – это вещество, которое стимулирует повышенный гуморальный и / или клеточный иммунный ответ на совместно введенный антиген. Система доставки представляет собой носитель для обеспечения презентации вакцины клеткам иммунной системы или для стабилизации и высвобождения антигенов в течении длительного периода времени. Адъюванты и системы доставки могут перекрываться по структуре и функциям. Ожидается, что многие будущие вакцины будут содержать новые адъюванты и системы доставки.

220

Адъюванты. Соли алюминия, такие как гидроксид или фосфат, на данный момент являются единственными адъювантами, широко лицензированными для использования людьми. Эти адъюванты уже используется в течение десятилетий в вакцинах, которые вводились более чем 1 млн. людей во всем мире. Вакцинный антиген образует стабильную связь с солью алюминия за счет ионных связей, и образует макроскопическую суспензию в растворе. Этот адъювант преимущественно стимулирует иммунную реакцию типа Th-2, т.е. основанную на антителах, что не является полезным в случаях, когда для защиты необходим опосредованный клетками иммунный ответ. Хотя соли алюминия полезны для некоторых вакцин (например, гепатит В, коклюш), в случае остальных вакцинных антигенов они не обладают достаточной мощностью, чтобы стимулировать иммунный ответ, опосредованный антителами, достаточно высокий для оптимальной эффективности. Показано, что соли алюминия не обладают пользой для презентации вакцин, вводимых пероральным или интраназальным путем. Поэтому многие химические вещества, биохимические вещества из природных источников, а также белки, обладающие активностью по отношению к иммунной системе (цитокины) исследовались в качестве потенциальных адъювантов. Адъювантная способность практически всех известных составов связана с местными или системными побочными эффектами, которые могут быть основаны на определенном механизме, или быть неспецифическими. Идеальный адъювант должен сохранять баланс между степенью побочных эффектов и усилением иммунного ответа.

Некоторым бактериальным токсинам с АДФ-рибозилирующей активностью уделялось значительное внимание при их рассмотрении в качестве адъювантов слизистых оболочек в молекулярной инженерии. В частности, было показано, что столбнячный токсин обладает активностью адъюванта слизистых оболочек для совместно вводимого антигена, презентируемого пероральным, назальным, вагинальным или ректальным путями, как было впоследствии показано для термолабильного токсина (LT) ETEC. Эти токсины состоят из каталитической субъединицы А и пентамерной субъединицы В, которая связывается с ганглиозидом GM1 на мно-

221

гих типах клеток. Однако, и столбнячный токсин, и LT токсичны для людей, особенно при пероральном введении, в результате которого они вызывают диарею. Для разделения токсичности и адъювантной способности столбнячного токсина и LT были созданы точечные мутации, которые привели к снижению или исключению АДФ-рибозилирующей активности, снижению токсичности, и заметному сохранению адъювантной способности у мышей. Альтернативным подходом была элиминация В-субъединицы и ее замена на синтетический димерный пептид, полученный на основе белка А Staphylococcus aureus, который связывается с иммуноглобулином (Ig). Несомненный интерес представляют данные о возможности использования в качестве адъювантов ганглиозидов GT1 и GD1a, которые при введении животным их комплекса с вирусом бешенства SVS повышали иммуногенность вируса и снижали летальность зараженных вирусом мышей. Переносимость и эффективность адъювантов, созданных генно-инженерным путем, должны проходить оценку на людях. Тема адъювантов подробно рассмотрена нами в учебном пособии: Краснопольский Ю. М., Борщевская М. И. «Фармацевтическая биотехнология: Технология производства иммунобиологических препаратов».– Харьков,

НТУ «ХПИ», 2009 г.

Системы доставки. Помимо презентации антигена или ДНК клеткам иммунной системы, система доставки может осуществлять другие ключевые функции. Может иметь место «эффект депо», когда поддерживается наличие антигена в определенном месте in vivo для постоянной стимуляции иммунной системы. Может происходить усиление стабильности вакцины in vivo. Для вакцин, вводимых через слизистые оболочки, система доставки может обеспечить эффективную презентацию и поглощение М-клетками, после чего происходит трансцитоз в пейеровы бляшки и презентация лимфоцитам с целью индукции иммунитета слизистых оболочек. Для некоторых составов вакцина может поддерживаться in vivo внутри физической структуры в течение значительного периода времени, на протяжении которого она высвобождается медленно или в пульсирующем режиме, чтобы она могла функционировать как однократно вводимая вакци-

222

на. Широко лицензированных систем доставки не существует. Наработка клинического и фармацевтического опыта с новыми системами доставки и адъювантами остается ключевой целью в данной области.

В заключении хотелось бы сказать, что технологические разработки последнего десятилетия значительно расширили число общих стратегий создания новых вакцин. В следующем десятилетии количество подходов будет и дальше расширяться, а технические аспекты дополнительно оттачиваться, чтобы большинство антигенов можно было представить в высокоиммуногенной форме в виде живой или субъединичной вакцины. Белковые антигены в альтернативной форме можно представить в виде вакцины на основе нуклеиновых кислот. Дальнейшее понимание функций генов вирусных и бактериальных патогенных организмов может позволить более стабильно и предсказуемо аттенуировать живые вакцины, как в виде вакцин, так и в виде живых векторов для иммунизации против других патогенных организмов. Технологии адъювантов должны развиваться до тех пор, пока составы, более действенные, чем соли алюминия, и настолько же хорошо переносимые, не станут широко применимыми для субъединичных / инактивированных вакцин, и пока не станет возможной пероральная доставка очищенных белков для иммунизации. Аналогичным образом, составы ДНК могут улучшить действенность ДНК-вакцин и их пригодность для доставки путями, стимулирующими иммунитет слизистых оболочек.

Весьма вероятно, что по мере совершенствования этих биотехнологических достижений лимитирующим фактором в разработке новых вакцин для применения людьми будет оставаться более полное понимание иммунологии. Одной из областей, в которых возрастание знаний имело бы практическую пользу для разработки вакцин, являются иммунобиология белков, тип и специфичность иммунной реакции, требуемые для постоянной защиты от заболевания, приобретение иммунитета слизистых оболочек, а также оптимальная стратегия вакцинации для достижения такой защиты. Ожидаются и значительные достижения в области применения вакцин к лечению неинфекционных заболеваний, таких как рак и аутоиммунные болезни.

223

6.2. Биотехнология цитокинов

Цитокины (медиаторы) – вещества белковой природы, которые образуются преимущественно в иммунокомпетентных клетках и являются средством клеточного взаимодействия. Они обеспечивают теснейшую функциональную связь между различными группами клеток. В настоящее время описано более 100 различных цитокинов, составляющих самостоятельную систему регуляции иммунной системы. Практически все описанные цитокины участвуют в развитии антиинфекционного иммунитета (см. табл. 15). Отдельные медиаторы достаточно хорошо изучены, клонированы их структурные гены, получены гомологичные образцы цитокинов, определена их аминокислотная последовательность.

Таблица 15 – Цитокины иммунного ответа

Продолжение таблицы 15

Продолжение таблицы 15

Продолжение таблицы 15