Материал: Фарм производство БАР

последовательностей длиной порядка 6–20 последовательных аминокислотных остатков полипептида. Некоторые линейные эпитопы обладают слабой иммуногенностью при их презентации на фоне полного полипептида. В других случаях природные пептиды были бы эффективными вакцинными антигенами, если бы их можно было сделать достаточно иммуногенными. Линейные В-клеточные эпитопы данного типа были определены для малярийного белка сиркумспорзойте (CS) (повторная последовательность, состоящая из 4-х аминокислотных остатков) и для белка пилус Pseudomonas aeruginosa. Оба эти полипептида содержат линейные эпитопы, распознаваемые антителами, которые нейтрализуют соответствующие патогенные микроорганизмы, однако целые полипептиды лишь слабо стимулируют выработку таких антител. Интересно предположение, что это явление может представлять собой механизм, при помощи которого эти и другие патогенные организмы эволюционировали с целью избегания иммунологического контроля, делая свои эпитопы нейтрализации менее иммуногенными.

Применение следующих стратегий (слитый белок, конъюгат, комплексный пептид) к слабо иммуногенным линейным эпитопам привело к иммуногенным презентациям, стимулирующим значительно более высокие титры нейтрализующих антител в сравнении с теми, которые стимулируются эпитопами, презентированными на фоне природного целого полипептида. Тем не менее, наиболее эффективная стратегия по показателям конечной клинической пользы должна определяться в зависимости от конкретного случая.

Носители, основанные на слитом белке. Иммуногенность линей-

ных эпитопов можно повысить при помощи генетического слияния определенных эпитопов с белком-носителем, который формирует крупную частицу с целью улучшения иммунной презентации пептида. Двумя обычно используемыми белками – партнерами по слиянию такого типа являются HBsAg и ядерный белок гепатита В (частица размером 28 нм, кодируемая вирусом гепатита В). Слияние может происходить по N-концу, C-концу или внутренней части полипептидной последовательности белка-партнера, в зависимости от того, какое расположение обеспечивает наилучшую им-

208

муногенную презентацию при сохранении эффективного формирования частиц.

Носители, основанные на конъюгатах. Пептид может быть хими-

чески конъюгирован с белком-носителем. Пептидная последовательность синтезируется химическим путем вместе с реактивным аминокислотным остатком, при помощи которого происходит конъюгация с белкомносителем. Наиболее часто используемыми белками-носителями в конъюгатах являются бактериальные белки, с которыми часто сталкивается человек, такие как столбнячный токсоид (TT), конъюгат которого с малярийным эпитопом CS прошел клинически испытания.

Носители, основанные на комплексном пептиде. Можно синтези-

ровать мультимеры пептидной последовательности для совместного связывания в повторяющиеся массивы, что применяется для пептидных эпитопов малярийного CS и gp120 HIV-1.

Носители, основанные на Т-клеточных эпитопах. Пептидные эпитопы, распознаваемые CTL, могут быть полезными иммуногенами для профилактики инфекций, вызываемых такими возбудителями, как HIV, или для иммунотерапии хронических заболеваний, таких как гепатит В. Эпитопы пептида CTL обычно являются слабыми иммуногенами. Поэтому для иммунотерапевтической вакцины гепатита В эпитоп CTL из ядерного белка HBV был модифицирован путем ковалентного связывания с Т-хелперным эпитопом (из токсоида столбняка), а также с двумя молекулами пальмитиновой кислоты. В ходе клинических испытаний было показано, что данная вакцина обладает достаточной иммуногенностью для стимуляции HBV-специфических CTL и CTL памяти. Меланомаспецифические Т-клеточные эпитопы в виде пептидов использовались в импульсной обработке дендритных клеток in vitro для доставки пациенту. При этом наблюдалось некоторое снижение размера опухоли.

Носители, основанные на полисахаридах. Ряд грамотрицательных и грамположительных бактерий образуют капсульную структуру, содержащую полисахариды (ПС). Способность бактерий к образованию капсул в значительной степени определяет взаимодействие между бактериальными клетками и организмом хозяина при развитии инфекционного процесса. Капсульные антигены играют важную роль в вирулентности и иммуноген-

209

ности бактерий. Имеется зависимость между наличием у бактерий капсулы и их токсичностью. Установлено, что гемолитическая активность также свойственна преимущественно капсульным формам бактерий. Капсульные антигены способны подавлять фагоцитоз бактерий и создавать условия для размножения возбудителей инфекции в организме хозяина. Капсульные полисахариды несут в себе основную серологическую антигенность бактериальных видов и успешно взаимодействуют с антителами к данным бактериям. Такие полисахариды представляют собой эффективные вакцинные антигены. В качестве примера использования полисахаридных вакцин можно привести препарат, содержащий очищенные капсульные полисаха-

риды Streptococcus pneumoniae (Pneumo 23 – PPV 23). Вакцина полива-

лентна и содержит полисахариды из 23-х серотипов бактерий. Вакцина PPV 23 (Sanofi Pasteur) эффективна против 90 % нечувствительных к пенициллину пневмококков и 96 % пневмококков, вызывающих заболевания. В некоторых случаях для конкретного патогенного организма имеется единственный серотип полисахарида, например, Haemophilus influenzae типа b (HIb) против инвазивного менингита H. Influenzae типа b. В этом случае можно создать моновалентную вакцину. Однако в большинстве случаев имеют место многочисленные серотипы капсульных полисахаридов (около 90 для Streptococcus pneumoniae), и такие вакцины должны быть мультивалентными, чтобы обладать достаточно высоким уровнем общей эффективности. Эти вакцины первого поколения были просто очищенными полисахаридами и обладали низкими протективными свойствами.

Гемофильная инфекция (возбудитель – Haemophilus influenzae b) является основной причиной гнойного менингита у детей до двух лет жизни, который часто приводит к серьезным неврологическим осложнениям и летальным исходам. Кроме менингита Haemophilus influenzae b вызывает перикардиты, эндокардиты, перитониты и другие гнойно-септические заболевания. Заражение происходит воздушно-капельным путем. По данным ВОЗ ежегодно от данных инфекций умирает около 500000 детей во всех странах мира.

Во многих, если не в большинстве изученных инкапсулированных бактерий, антитела, направленные против капсульных ПС, способны за-

210

щищать от инфекции. Эти наблюдения позволили использовать капсульные ПС в качестве вакцинных антигенов.

6.1.6. Индивидуальные полисахаридные вакцины

Нативный капсульный ПС содержит до сотен повторяющихся единиц, характерных для каждого вида бактерий и антигенного подтипа, в котором каждый мономер состоит из сочетания моносахаридов, фосфатных групп и мелких органических компонентов. ПС высвобождаются организмом по мере его роста и собираются из культуральной среды. Эти препараты ПС обычно обладают иммуногенностью для взрослых и детей старше 2-х лет и стимулируют выработку антител, которые могут опосредовать опсонизацию организма, таким образом, защищая его от инфекции. Вакцины ПС лицензированы для Hib64 (моновалентные для серотипа b),

Neisseria meningitides (квадривалент) и Streptococcus pneumoniae

(23-валентный). Недостаток этих вакцин состоит в том, что ПС, будучи иммуногенами, независимыми от Т-клеток (TI), обладают слабой иммуногенностью или не обладают иммуногенностью у детей младше 2-х лет, и не стимулируют иммунологическую память у старших детей и взрослых.

Конъюгированные вакцины. Хотя дети младше 2-х лет не могут эффективно распознавать иммуногены TI, они могут проявлять иммунологические реакции на зависимые от Т-клеток (TD) иммуногены, например, белки. Химическая конъюгация ПС с белком-носителем превращает ПС из TI в TD иммуноген. Вследствие этого, вакцины в виде конъюгата Ps-белок могут стимулировать защитный иммунитет IgG и иммунологическую память у младенцев и маленьких детей. Данная стратегия особенно важна для инкапсулированных бактерий, таких как Hib и S. pneumoniae (пневмококковые; Pn), вследствие преобладания инвазивных заболеваний, вызываемых этими бактериями у детей младше двух лет, для которых вакцина ПС неэффективна.

Первая лицензированная вакцина Haemophilus influenzae b (HIb) содержала полирибосилрибатолфосфат (PRP), полисахарид капсулы микроорганизма. Однако полисахаридная вакцина была недостаточно иммуногенна для детей младше 2-х лет. В связи с этим она была разрешена к ис-

211

пользованию только для детей старше 18 месяцев. Изучение в Финляндии (1977 г.) подтвердило значительное снижение HIb-заболеваний и эффективность PRP-вакцины в 90 % случаев. В то же время изучение вакцины в США показало её менее надежную эффективность. В результате этих исследований и существенной потребности иметь вакцину для малолетних детей начались разработки по созданию конъюгированных вакцин. Такие

конъюгированные вакцины, в которых HIb-полисахарид связан с белком, обладают рядом преимуществ:

индуцируют высокие титры антител;

более иммуногенны для малолетних детей;

демонстрируют высокий иммунный ответ при ревакцинации.

В1989 году было разрешено к использованию у детей младше 18 месяцев четыре конъюгированных вакцин:

 PRP-D – содержала полисахарид, конъюгированный с дифтерийным анатоксином;

 HbOC – содержала полисахарид, конъюгированный с нетоксичным мутантным дифтерийным токсином, известным как CRМ197;

 PRP-OMR – содержала полисахарид, конъюгированный с белком наружной мембраны Neisseria meningitidis;

 PRP-T – содержала полисахарид, конъюгированный со столбнячным анатоксином.

Доза каждой вакцины составляет 0,5 мл.

Вакцины содержат различное количество полисахарида и конъюгированного белка, причем соотношения полисахарида к белку значительно отличаются (см. табл. 14). Изучение иммуногенных свойств четырех вакцин в процессе трех иммунизаций продемонстрировало существенные отличия в продукции антител.

212

Таблица 14 – Состав комбинированной вакцины

Hemophilus influenzae b (HIb)

3-В-D-рибофунарозил (1-1)-D-рибитол-5-фосфат.

Таким образом, сегодня на рынке вакцин присутствует четыре различных лицензированных вакцины – конъюгатов Hib. Все они имеют разные белки-носители (TT, DT, CRM197 и внешний мембранный белковый комплекс N. meningitidis группы B) с разными размерами и иммунологическими параметрами, различные длины цепи Ps и различные технологии конъюгации. Учитывая эти различия, четыре вакцины имеют одно или бо-

лее различий по следующим иммунологическим свойствам: реакция 2-х ме-

сячных младенцев на первую дозу вакцины; реакция 4-х и 6-ти месячных младенцев на вторые и третьи дозы; реакция детей старше 1 года на бустерную дозу; кинетика снижения уровней антител; пик титра антител и возраст, в котором может впервые проявиться защита от клинического заболевания.

Бактерия Pn (пневмококковая) состоит примерно из 90 серотипов, что отражается в отличных структурах капсулярных ПС. Для создания педиатрической конъюгированной вакцины Pn было определено 7 серотипов,

213

ответственных за 60–75 % основных педиатрических заболеваний Pn (острый средний отит, пневмония, менингит). Недавно была лицензирована семивалентная вакцина. Другие вакцины, проходящие расширенные клинические испытания, состоят из смесей до 11 отдельных конъюгатов

Pn ПС.

6.1.7. ДНК вакцины. Вирусная и бактериальная доставка

Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основанный на включении в клетки животно- го-мишени гена, кодирующего белок-антиген привел к появлению нового типа вакцин – ДНК-вакцин. Обнаружено, что фрагменты ДНК вирусов и бактерий, имплантированные в клетки животных, способны синтезировать собственные белки. Сами клетки, получившие гены другого организма, в ответ начинают вырабатывать антитела на вновь синтезируемые белки. Эксперименты по созданию ДНК-вакцин преимущественно ведутся с бактериальными плазмидами – небольшими стабильными кольцевыми ДНК, которые содержатся вне хромосом. Плазмиды хороши в том плане, что сами по себе не провоцируют развитие инфекции. Их используют в качестве вектора – средства доставки. Для того чтобы вызвать необходимый иммунный ответ, выделенные из бактерий плазмиды модифицируют, внося определенные изменения в структуру ДНК, а именно, «вшивают» гены, которые кодируют один или несколько определенных белков-антигенов, вырабатываемых конкретными вирусами или бактериями. Так же встраиваются в плазмиду гены, необходимые для обеспечения экспрессии всей конструкции. Очень важно, что фрагменты ДНК, ответственные за воспроизводство и развитие инфекционного процесса в плазмиды не вводятся.

Одной из стратегий было внутримышечное введение раствора ДНК, кодирующего вакцинный антиген. Клетки поглощают плазмидную ДНК, транскрибируют ее и синтезируют антиген, который может проходить такую же обработку, как и в процессе вирусной инфекции. Преимуществами использования ДНК являются относительная техническая простота изготовления и возможность направлять синтез многочисленных копий мРНК туда, откуда следует ожидаемое усиление как синтеза антигена, так и иммунной реакции. Такие вакцины проявили свою эффективность на многих

214

животных моделях инфекции, особенно вирусных моделях. В поисках нового пути доставки ДНК без оболочки наносили на кожу мышей, откуда она поглощалась волосяными фолликулами с целью стимуляции иммунного ответа. Хотя ДНК без оболочки и оказывает стимулирующее воздействие на выработку специфических антител, она особенно эффективно стимулирует клеточные иммунные реакции.

Особо необходимо остановиться на вирусной доставке ДНК-вакцин. Все вышеуказанные вакцины на основе нуклеиновых кислот приводят к помещению плазмиды в клетку. С целью доставки ДНК при помощи вируса оспы домашней птицы экспрессионная кассета рекомбинантного белка интегрируется в вирусный геном. Эти птичьи поксвирусы могут инфицировать клетки млекопитающих (человека), но не могут продуцировать инфекционный вирус, следовательно, данный подход можно считать основанным на нуклеиновых кислотах. Этого единственного цикла самоограничивающей инфекции может быть достаточно для стимуляции широкого иммунитета против патогенного организма, рекомбинантный полипептид которого экспрессируется этими птичьими поксвирусами в инфицированных клетках, в то время как реактогенность должна быть минимальной, учитывая неспособность вируса распространяться в организме хозяина. Одним из вариантов конструкции экспрессионной плазмиды является применение системы экспрессии ДНК на основе вируса, который может повышать уровень РНК и белковой экспрессии, что происходит при живой вирусной инфекции, как было разработано для вирусных векторов Sindbis.

Использование векторов для конструирования и производства вирусоподобных частиц в качестве вакцин является весьма перспективным. Аденовирусы многие годы используются в качестве инструмента в модельных исследованиях по генотерапии. В последние годы преимущества векторов на основе аденовирусов привлекают специалистов в области конструирования рекомбинантных вакцин. Особенно ценной является высокая продуктивность аденовирусов и высокая эффективность переноса генов и экспрессии. Векторы для вакцин конструируются с делециями по ранним генам Е1 и Е2. В ряде исследований аденовирусные векторы используют для экспрессии индивидуальных вирусных антигенов и, в частности, гемагглютининов вирусов гриппа. Серьезным недостатком этих векторов является наличие в популяции людей широко распространенного иммуните-

215