ного стимула у животных. Оптимизация экспрессии рекомбинантных полипептидов остается важной технической задачей для всех этих живых вирусных векторов.
РНК-вирусы могут быть сконструированы аналогичным образом. Sindbis и другие α-вирусы пользовались повышенным вниманием благодаря их широкому спектру, способности инфицировать неделящиеся клетки, а также потенциальному высокому уровню экспрессии в пересчете на клетку. Учитывая эти свойства, из Sindbis была разработана вакцина на основе нуклеиновой кислоты.
Бактериальные векторы. На основе патогенных бактерий можно сконструировать живые рекомбинантные векторы для экспрессии чужеродных полипептидных антигенов. Наиболее частым способом применения было конструирование желудочных патогенных организмов таким образом, чтобы они могли индуцировать иммунитет слизистых оболочек против чужеродного полипептида при его пероральном введении. В сфере разработки живых бактериальных векторов максимальные усилия, касающиеся разработки штаммов, иммунологии, молекулярных разработок и клинических испытаний были сконцентрированы на S. typhi. V. cholera и S. flexneri также были превращены в рекомбинантные векторы для перорального введения для клинической оценки. Проблемой таких живых аттенуированных векторов остается сохранение достаточной вирулентности для репликации в пищеварительном тракте и экспрессия чужеродных полипептидов на необходимом уровне, а также достижение достаточной аттенуации для обеспечения хорошей переносимости. Способность некоторых из этих видов бактерий реплицироваться внутри клетки может усилить способность экспрессируемых чужеродных полипептидов стимулировать клеточные иммунные реакции против соответствующих патогенных организмов.
6.1.3. Субъединичные / инактивированные вакцины
Преимущество субъединичных вакцин состоит в их неспособности размножаться в организме хозяина. Обычно они хорошо переносятся, особенно вакцины, подвергающиеся многоступенчатой очистке с целью удаления других макромолекул. Иммуногенность такой вакцины можно усилить путем ее совместного введения с адъювантом или при помощи систе-
198
мы доставки. Тем не менее, следует начинать программу разработки с пониманием того, что для достижения длительного защитного иммунитета требуется неоднократное введение вакцины, зачастую – с последующим введением бустерных доз. Такие вакцины обычно функционируют путем стимулирования гуморальной иммунной реакции, а также инициирования иммунологической памяти.
Необходимо отметить, что конструирование рекомбинантных вирус-
ных вакцин включает в себя:
клонирование и экспрессию в различных векторах индивидуальных вирусных генов с целью получения вирусных антигенов в различных экспрессионных системах в качестве высокоочищенных вакцинных препаратов;
клонирование и экспрессию индивидуальных вирусных антигенов
сцелью получения вирусоподобных частиц;
клонирование и экспрессию вирусных антигенов в эукариотических векторах с целью получения ДНК-вакцин.
Для рассмотрения данного вопроса остановимся на противогриппозных вакцинах. На поверхности вирусной частицы локализуются следующие белки-антигены: гемагглютинин (H), нейраминидаза (N) и белок M2. Установлено, что в «головке» апикальной части молекулы H локализуется 5 антигенных сайтов и вируснейтрализующая активность антител связана с иммунным ответом на эти сайты. Антитела к H блокируют взаимодействие вируса с клеточными рецепторами, т.е. инфицирование клеток. Антитела к N блокируют выделение вирусов инфицированными клетками (т.е. распространение инфекции). Антитела к белку M2 также в значительной степени блокируют отсоединение инфекционных вирусных частиц от мембран инфицированных клеток. Исходя из вышесказанного ясно, что из трех основных поверхностных белков принципиальное значение имеет Н. Это и лежит в основе технологии производства субъединичных вакцин, содержащих преимущественно Н. Считается, что иммунитет на N имеет вспомогательное значение. Белок М2 в силу высочайшей консервативности стал объектом для конструирования универсальной вакцины против гриппа А.
Таким образом, рекомбинантные вакцины с использованием индивидуальных компонентов вирусов гриппа типа А ориентированы главным
199
образом на ключевой и сильно вариабельный компонент вируса – молекулу Н. Из внутренних антигенов вирусной частицы активно рассматриваются в качестве материала для получения вакцин белки NP, M1, NS1.
6.1.4. Цельные патогенные организмы
Самый ранний подход к изготовлению инактивированных вакцин состоит в использовании целых бактерий или вирусов с целью стимулирования образования антител ко многим антигенам, некоторые из которых смогут нейтрализовать патогенный организм.
Бактерии. Эти вакцины изготавливаются путем культивирования бактерий, сбора клеток и их инактивации при помощи нагрева или химических агентов, таких как мертиолят или фенол, формалин. Конечная вакцина не подвергается дальнейшей очистке. Благодаря отсутствию очистки таких вакцин, которые содержат практически все бактериальные клеточные компоненты (а также продукты метаболизма и следовые количества питательных сред), реактогенность таких вакцин при их парентеральном введении (например, Bordetella pertussis или St. aureus ) обычно выше, чем у других типов вакцин. С другой стороны, инактивированные цельноклеточные вакцины V. cholerae и энтеротоксигенной Escherichia coli (ETEC) хорошо переносились при пероральном введении. Пероральная инактивированная цельноклеточная вакцина холеры (WCC), лишенная токсина (и его токсического воздействия) оказалась хорошо переносимой, а ее уровень эффективности составил примерно 60 % при испытании на популяции высокого риска в течение 3-х лет. Для стимуляции антител, которые смогут нейтрализовать токсины и повысить эффективность, рекомбинантная В-субъединица токсина, не обладающая активностью токсина, независимо экспрессируется, очищается, и вновь добавляется к вакцине WCC. Показано, что эта комбинированная вакцина WCC + r-токсин имеет несколько более высокий уровень эффективности, чем сама вакцина WCC.
Вирусы. Некоторые инактивированные вирусные вакцины используются уже в течение десятилетий, и обычно хорошо переносятся. Поскольку вирусы при выращивании in vitro, как правило, выходят в клеточную культуральную среду, то собирают среду от инфицированных культур, не содержащую клеток. Крупный размер частиц вирусов в сравнении с
200
другими макромолекулами среды позволяет легко отделить частицы с использованием простых технологий очистки, построенных на разделении частиц по размеру. К примерам таких вакцин относятся вирус полиомиелита, вирус гриппа, вирус бешенства и вирус японского энцефалита. В альтернативном подходе, применяемом в случае убитой вирусной вакцины гепатита А (HAV), инфицированные клетки подвергают лизису и проводят очистку вирусных частиц. Вирусные частицы инактивируются химическим путем, обычно при помощи обработки формалином, а затем их действие может усиливаться за счет адъювантов (например, гидроокиси или фосфата алюминия). Возможно использование липосом для усиления иммуногенности вирусных вакцин. Защитные эпитопы на поверхности многих не капсулированных мелких вирусов, стимулирующие защитную иммунную реакцию часто имеют конформационную структуру, будучи сформированными из высокоорганизованной совокупности структурных белков в антигенные структуры. Для большинства перечисленных вирусов, для которых были разработаны и зарегистрированы инактивированные вакцины, оказалось невозможным полностью воссоздать конформацию таких эпитопов при помощи других технологий, например, рекомбинантных полипептидов. Инактивированные вирусные вакцины обычно обладают высокой иммунологической активностью, например, 1 доза вакцины гепатита А обеспечивает защиту в количестве 50 нг. Таким образом, эта классическая стратегия, характеризующаяся безупречной историей создания хорошо переносимых и эффективных вакцин, остается весьма перспективной технологией, избираемой для многих вирусных вакцин.
6.1.5. Белковые вакцины
Разработка вакцины на основе белка является предпочтительной стратегией для многих патогенных организмов, в которых полипептид содержит защитные эпитопы, учитывая вышеуказанные моменты, касающиеся инактивированных вакцин. Подходы, берущие за основу белок, построены на генетических, биохимических и иммунологических методиках, позволяющих выявлять защитные эпитопы и их соответствующие полипептиды как возможные вакцинные антигены.
201
В последнее время биотехнологи, вместо ранее необходимых биохимических данных или информации об антигенах, позволяют выявлять новые вакцинные антигены. Как только получена полная последовательность (или ее части) геномной ДНК или РНК, выявляются открытые рамки считывания. Полученную аминокислотную последовательность можно проверить на наличие структурных свойств, таких как гомология с белками других родственных патогенных организмов, являющихся кандидатами для создания вакцин, или гидрофобные N-концевые последовательности, предполагающие поверхностную локализацию. Гены экспрессируются в рекомбинантных клетках хозяина (обычно E. coli), а рекомбинантный полипептид очищается и используется для иммунизации животных с целью получения поликлональных антител, чтобы выявить, вырабатывается ли патогенным организмом данный гипотетический белок. Антисыворотку можно использовать также для биологических анализов (нейтрализация вирусов, опсонизация бактерий), чтобы проверить, может ли данный белок быть привлекательным кандидатом для создания вакцины. Новый белок может также использоваться для иммунизации и контрольного заражения животной модели. Некоторые из ранних приложений технологии геномики к вирусам имели целью выявление вируса гепатита С (HCV) и вируса гепатита Е (HEV), что привело к непосредственному определению вероятных вакцинных антигенов. Геномный подход был применен и к Neisseria meningitidis, в ходе чего было обнаружено несколько вероятных вакцинных антигенов.
Природные источники антигенов. Первые вакцины на основе бел-
ка были построены на природных источниках антигенов. В данном отношении уникальна вакцина гепатита В первого поколения. Уникальность состоит в том, что в ней в качестве источника вакцинного антигена используется ткань человека (плазма).
Гепатит В – заболевание, передающееся парентеральным или половым путем и являющееся 9-ой причиной заболеваемости и смертности на планете. Инфицирование вирусом гепатита В вызывает различные клинические проявления: молниеносную, острую, хроническую и скрытую формы гепатита. Молниеносная и острая формы являются крайне тяжелыми, и дают высокую смертность. Хронический гепатит несет ответственность за
202
распространение вируса и потенциально может развиться в цирроз и рак печени. Каждый год умирает более миллиона хронических вирусоносителей. Вакцинопрофилактика является единственным эффективным способом предупреждения этого заболевания.
Первоначально была создана вакцина для профилактики гепатита В, получаемая из плазмы человека. Весьма интересен опыт, накопленный в ходе создания инактивированной вакцины против вируса гепатита В, который, как известно, не культивируется in vitro и не размножается в организме пригодных для широкого использования животных. Клетки печени людей, хронически инфицированных вирусом гепатита В, выделяют избыток вирусного поверхностного белка, т.е. поверхностного антигена гепатита В (HBs-Ag) в кровь в виде вирусоподобных частиц размером 22 нм с защитными эпитопами. Поэтому для производства вакцины было предложено извлекать из плазмы клинически здоровых антигеноносителей поверхностный антиген (HBs-Ag), очищать и концентрировать его, а затем инактивировать формалином. Антиген выделяли с помощью ультрацентрифугирования, хроматографии и ферментативной обработки. Полученный препарат подвергали инактивации для уничтожения вируса гепатита В и других потенциально патогенных контаминантов для организма человека. Препарат проходил клинические испытания в США, Франции, Англии, Голландии, Японии. Однако, в связи с технологическими трудностями при получении вакцины, ограниченностью в сырье и возможности контаминации препарата, эта вакцина не получила широкого применения.
С 1987 г. стали доступны две рекомбинантные вакцины, вырабатываемые дрожжами и содержащие главный поверхностный белок вируса гепатита В – S-белок (HBs-Ag), производимые лидерами производства вак-
цин: «Merck Sharp Dohme» (СШA) и «Smith Kline Beecham» (Бельгия).
Оценка, проведенная FDA, признала безопасность вакцины против гепатита В на основе исследования 12 млн. доз, введенных детям в возрасте до 12 месяцев. Вакцина продемонстрировала высокую эффективность для защиты от гепатита В. В настоящее время, рекомбинантную вакцину для профилактики гепатита В выпускают: «GlaxoSmithKline» (Бельгия), «Heberbiotec» (Куба), «Berna Biotech» (Корея), «Instituto Butantan» (Брази-
лия), Научно-производственная компания «Комбиотех» (Россия) и ряд
203
других производителей. В Украине данная вакцина входит в перечень обязательных прививок.
Белки, очищенные из культур B. pertussis, комбинируются для создания неклеточных вакцин против коклюша, которые со временем должны заменить цельноклеточную вакцину коклюша для текущих педиатрических вакцинаций во многих развитых странах. В зависимости от количества различных белковых антигенов, эти вакцины называют одно-, двух-, трех-, четырехили пятикомпонентными вакцинами. Данные вакцины были зарегистрированы на основании недавних исследований эффективности. Все эти вакцины содержат в качестве компонента токсоид коклюша, подготовка которого описана ниже.
Химическая инактивация. Многие бактерии вырабатывают белковые токсины, ответственные за патогенез инфекции. Уже несколько десятилетий назад стало известно, что если токсин после инфицирования оставался патогенным, антитоксины (антисыворотка, обогащенная токсинспецифическими антителами), являвшиеся эффективными в нейтрализации активности токсина in vivo, могут предотвратить или изменить в лучшую сторону симптомы некоторых бактериальных инфекций. Этот прецедент послужил основой для введения бактериальных токсинов в состав активных вакцин. Молекулы токсина очищаются из бактериальных культур
(например, Corynebacterium diphtheriae (D), Clostridium tetani (T),
B. pertussis (P)), а затем проходят детоксикацию путем инкубации с таким химическим реагентом, как формалин или глутаральдегид. Токсины, лишенные токсических свойств, называемые токсоидами (анатоксинами), представляют собой две части (D, T) комбинированной вакцины против дифтерии, столбняка и коклюша (DTP). PT45, совмещенный с другими антигенами коклюша, составляет ацеллюлярные коклюшные вакцины. В основе процесса обезвреживания токсина заложен принцип необратимого изменения участка его белковой молекулы, ответственного за проявление токсичности, при полном сохранении антигенной активности. Например, метод детоксикации дифтерийного токсина формальдегидом при температуре 37 °С был предложен Рамоном в 1924 году. При изучении механизма анатоксинообразования было установлено, что процесс перехода токсина в анатоксин проходит в два этапа.
204
Первый этап связан с реакцией между формальдегидом и NH2- группами белка. При этой реакции образуется метилоаминная группа. На этом этапе детоксикация дифтерийного токсина протекает очень быстро; уже в 1–2-е сутки наблюдается снижение токсичности на 95 %. Однако такое обезвреживание обратимо, и если из препарата удалить избыток формалина, токсичность восстанавливается (реверсия).
На втором этапе происходят внутримолекулярные реакции: метилоаминные группы взаимодействуют с некоторыми активными радикалами аминокислот (амидные, индольные, фенольные и др. группы), что приводит к созданию стабильных метиленовых мостиков. Стабильного обезвреживания можно добиться только после второго этапа формальдегидной детоксикации – образования метиленовых групп. Второй этап необратим. Он протекает достаточно медленно (20–40 суток) при температуре 39–40 °С в зоне нейтральных или слабо щелочных значений рН и завершается образованием дифтерийного анатоксина. Необходимо бы отметить, что условия детоксикации токсинов специфичны для каждого вида токсина.
Генетическая инактивация. Химическая процедура получения анатоксинов имеет определенные недостатки, в том числе изменение защитных эпитопов, ведущее к снижению иммуногенности, и потенциальный возврат к биологически активному токсину (реверсия). Для получения стабильных анатоксинов коклюша создавалась мутация кодонов аминокислот, требуемых для биологической активности токсина (аденозиндифосфат (ADP) рибозилтрансфераза). Измененный ген заменил собой нативный ген в родительском организме, на основе которого затем был получен иммуногенный, но стабильно инактивированный анатоксин коклюша. В усовершенствованном варианте этой стратегии в токсин коклюша были введены две мутации для обеспечения невозможности возврата в исходное состояние. Этот двойной мутант коклюшного токсина, который также обрабатывается формалином в более мягких условиях, чтобы улучшить его иммуногенность или стабильность, является компонентом ацеллюлярной вакцины коклюша. В близком к этому варианте применения, мутантные культуры C. diphtheriae скринировались для выявления секреции ферментативно неактивных, но антигенных молекул анатоксина. После-
205
дующее клонирование и секвенирование одного из таких мутантных генов токсина выявило мутацию одной аминокислоты в ферментативно активном сайте (также ADP-рибозилтрансферазы). Этот генетический анатоксин (CRM197)47 является белком-носителем лицензированной конъюгированной вакцины H. influenzae тип b (Hib). Данная технология применялась также к токсину V. cholerae (CT) и др.
Рекомбинантные полипептиды. Первым применением технологии рДНК при производстве вакцин было создание вакцины против гепатита В. С учетом того, что полученный из крови HBsAg проявил себя как хорошо переносимая и эффективная вакцина, ген S, кодирующий HBsAg, экспрессировали в пекарских дрожжах S. cerevisiae, что приводило к образованию частиц HBsAg размером 22 нм внутри клеток. Поверхность HBsAg подобна поверхности вирионов HBV. Вакцина, полученная из дрожжей, доступная во всем мире в больших количествах, в значительной мере вытеснила настолько же эффективную и хорошо переносимую вакцину на основе плазмы. Кроме того, HBsAg экспрессировали в трансгенных листьях табака и клубнях картофеля. Выделенный и очищенный HBsAg сохранял высокую иммуногенность.
Сейчас проводятся многочисленные научные исследования и разработки применения технологии рДНК к производству белков – возможных компонентов вакцин. Основной поверхностный белок Borrelia burgdorferi (OspA), экспрессированный в E. coli в виде рекомбинантного липопротеина, был зарегистрирован в качестве вакцины против болезни Лайма. Полученные рекомбинантным путем гликопротеины HSV, экспрессированные в клетках яичников китайского хомяка (CHO) и введенные в вакцину, были исследованы в клинических испытаниях.
Чаще всего крупные частицы более иммуногенны, чем отдельные полипептиды. Более того, как и в случае VLP HBsAg, частицы обычно стимулируют выработку антител на конформационные эпитопы частицы, в то время как изолированные поверхностные полипептиды частицы могут не стимулировать продуцирование таких антител. Вирион человеческого вируса папилломы (HPV) – это высокоорганизованная структура, основным белком которой является L1. Экспрессия L1 в эукариотических клетках (например, S. cerevisiae) приводит к образованию VLP L1, который по-
206
сле иммунизации стимулирует выработку антител, которые связываются с вирионами. Рекомбинантные VLP ротавируса и парвовируса также экспрессировались в виде потенциальных родительских вакцин.
Многие клетки хозяев использовались для экспрессии гетерологичных рекомбинантных генов. В дополнение к указанным ранее (E. coli, S. cerevisiae и CHO), были разработаны системы экспрессии для клеток из других видов бактерий и дрожжей, а также других стабильных клеточных линий (CCL) млекопитающих, например, клетки почки африканской зеленой мартышки (Vero). Целые животные и растения также могут использоваться в качестве хозяев для рекомбинантной экспрессии. В целом, более мелкие белки, не требующие посттрансляционных модификаций, могут эффективно экспрессироваться в исходной форме в микробных системах экспрессии. В отличие от этого, полипептиды, которым для иммуногенности требуются посттрансляционные модификации, например гликозилирование для надлежащей иммуногенности, экспрессируются в CCL млекопитающих, способных к правильному осуществлению таких модификаций.
Новым подходом в области рекомбинантных вакцин является при-
менение частиц дрожжей Ty в качестве убитых носителей чужеродных белков. Дрожжевая Ty – это частица, собираемая в S. cerevisiae, которая не способна к репликации в организме млекопитающих. Можно экспрессировать ген, кодирующий чужеродный белок, совместно с генами Ty таким образом, что чужеродные белки вместе с белками Ty будут собираться в смешанные частицы. Благодаря тому, что чужеродные белки экспрессируются на поверхности этих крупных частиц, их иммуногенность в качестве вакцинных антигенов может быть усилена.
Носители, основанные на белках. Во многих случаях было возмож-
но идентифицировать в составе полипептида В-клеточные эпитопы, против которых направлено действие нейтрализующих антител. Многие В-клеточные эпитопы являются конформационными, образующимися вследствие наложения в трехмерном пространстве остатков аминокислот из различных частей полипептида, что означает, что данным эпитопам для надлежащей иммуногенной презентации требуется полный полипептид. В отличие от этого, другие пептидные эпитопы линейны по своей природе, и обладают всеми антигенными свойствами даже в виде коротких линейных
207