Материал: Фарм производство БАР

Шерешевского – Тернера). Как у взрослых, так и детей соматотропин поддерживает нормальную структуру тела, стимулируя рост мышц и способствуя метаболизму жира.

На фармацевтическом рынке Украины присутствуют препараты рекомбинантного гормона роста человека: «Биосома» (Teva, Израиль), «Ге-

нотропин» (Pfizer Inc., Швеция), «Нордитропин» (Novo Nordisk, Дания), «Нутропин Aq» (Beaufour Ipsen International, США), «Растан» (Россия), «Сайзен» (Industria Farmaceutica Serono s.p.a., Италия) и др. Необходимо отметить, что препарат «Сайзен» получен методом генной инженерии с использованием линии клеток млекопитающих, а именно с помощью клеток молочной железы. Другие перечисленные препараты получены с использованием бактерий E. Coli.

5.3. Производство эритропоэтина человека

Эритропоэтин – гликопротеиновый гормон, образуемый клетками почек и печени в ответ на снижение парциального давления кислорода в крови (гипоксия) и обуславливающий начало эритропоэза. Это полипептид, состоящий из 165 аминокислот с молекулярной массой 30400 Da. Эритропоэтин широко применяют в клинической практике при заболеваниях сопровождающихся анемией. При анемии индукция эритропоэтина повышена, что стимулирует образование эритроцитов в костном мозге и приводит к коррекции анемии. Эритропоэтин показан больным с почечной недостаточностью и выраженной анемией. В настоящее время препараты эритропоэтина входят в число необходимых и часто используемых фармацевтических средств. Получение эритропоэтина из физиологического материала – процесс трудоемкий и затратный, что делает невозможным применение природного гормона в клинической практике. Альтернативным вариантом является получение белка методами генной и клеточной инженерии с помощью штамма-продуцента на основе перевиваемой культуры клеток, что позволяет получать более дешевый и доступный белок.

Культура клеток яичника китайского хомячка (штамм СНО) и её производные используются в качестве продуцентов различных рекомбинантных белков.

180

В Российском научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» была получена линия клеток штамма продуцента эритропоэтина человека (СНОрЕ) путем трансфекции клеток СНО ТК (дефектных по тимидинкиназе) рекомбинантной плазмидой, содержащей ген эритропоэтина человека, с последующей селекцией. Клетки СНОрЕ обеспечивают синтез и секрецию в культуральной жидкости белка рекомбинантного человеческого эритропоэтина (рчЭПО). Культура клеток состояла из эпителиоподобных и веретеновидных клеток с крупными ядрами неправильной формы, содержащими от одного до трех ядрышек; цитоплазма зернистая, вакуолизированная. Клетки субстратзависимы, склонны к неравномерному росту, образуют многослойные островки. При длительном культивировании в течение 23 последовательных пассажей морфология клеток не изменялась; индекс пролиферации культуры составлял 3–4; монослой формировался на 3-и сутки роста при кратности рассева 1 : 3–1 : 4. Хранение в жидком азоте не приводило к изменению свойств культуры клеток.

Клетки культивировали в питательной среде Игла МЕМ с добавлением 10 % сыворотки крови крупного рогатого скота и смеси ГАТ (13,61 мкг/мл гипоксантина, 0,191 мкг/мл аминоптерина, 3,88 мкг/мл тимидина). Культивирование проводили при температуре 37 °С. Культуру криоконсервировали и хранили при температуре минус 196 °С в жидком азоте.

Исследование специфической активности эритропоэтина in vitro показало, что штамм-продуцент обладает способностью выделять в культуральную среду целевой белок с активностью в среднем 247,6 МЕ/мл в сутки. Активность рчЭПО в течение времени культивирования увеличивалась с 102,2 МЕ/мл (первые сутки) до 332,1 МЕ/мл (четвертые сутки) и затем постепенно снижалась. Снижение активности, вероятно, связано с необратимыми процессами в клетках, недостатком питательных веществ и накоплением вредных метаболитов в среде. Очистка препарата основана на комбинации аффинной и ионообменной хроматографии. Получение сорбента для аффинной хроматографии – путем иммобилизации моноклональных антител к эритропоэтину человека, на CNBr (активированной Sepharose FF). Источником моноклональных антител является асцитическая жидкость мышей или культуральная жидкость. Сорбент уравновешивали фосфатным буфером, содержащим 0,02 % Твин-20. Культуральную

181

жидкость, содержащую эритропоэтин концентрировали на ультрафильтрационных волокнах с порогом отсечения 10 кDa при температуре 4–10 °С. Культуральную жидкость концентрировали в 10–20 раз (исходный объем – 28 л). Культуральную жидкость, содержащую 300 мг рекомбинантного эритропоэтина, наносили на колонку с аффинным сорбентом (высота столба сорбента 12,7 см). Сорбент промывали последовательно 4 объемами фосфатного буфера с 0,02 % Твина-20; 3-мя объемами фосфатного буфера, содержащего 1 М NaCl и 0,02 % Твина-20; 2-мя объемами фосфатного буфера с 0,02 % Твина-20. Элюирование проводили 0,1 М раствором лимонной кислоты. В 160 мл элюата – 285 мг белка эритропоэтина. Выход на этой стадии составляет 95 %. Чистота эритропоэтина более 95 %. Полученный раствор эритропоэтина подвергали диализу против 0,01 М трисбуфера с 0,02 % Твина-20, рН = 6,8. Затем эритропоэтин подвергают градиентной ионообменной хроматографии на Q-Sepharosа. Элюирование проводят линейным градиентом NaCl от 0 до 0,3 М раствором. Выход на этой стадии составляет не менее 75 %. Контроль препарата проводили методом ВЭЖХ и электрофореза в ПААГ. Чистота эритропоэтина не менее 98 %. Препарат гомогенен и представлен мономером.

Рассматривая технологии получения рекомбинантных белков нельзя не остановиться на получении данных продуктов с помощью трансгенных сельскохозяйственных животных. Использование сельскохозяйственных животных в качестве биореакторов рассматривается как альтернатива традиционным методам получения белков для фармацевтической промышленности. В результате генно-инженерных манипуляций домашние животные становятся живыми системами, продуцирующими рекомбинантные белки человека в кровь или молоко. Выбор трансгенных животных в качестве источника фармацевтических белков обусловлен тем, что в их организме могут осуществляться посттрансляционные модификации, делающие продуцируемые рекомбинантные белки биологически активными. Экспрессия рекомбинантных белков в молочной железе трансгенных животных может достигать 40 г/л, при этом выделение белков из молока возможно уже при их концентрации 25 нг/мл. С помощью трансгенных животных в лабораторных условиях получен широкий спектр рекомбинантных белков: антитромбин III, 1-антитрипсин, α-глюкозидаза, эритропоэтин, -интерферон, -лактоглобулин, С-протеин, сывороточный альбумин, -интерферон, факторы свертываемости крови VIII и IX. Для получе-

182

ния фармацевтических белков используют в основном 6 видов животных: мышей, кроликов, свиней, коз, овец и коров.

Основным методом получения таких трансгенных животных являет-

ся метод микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы. Отрицательным мо-

ментом является низкая эффективность трансгенеза (около 1 % от числа пересаженных эмбрионов), причем экспрессия трансгенов наблюдается только у 60 % полученных трансгенных животных. Существует подход, который позволяет устранить указанные недостатки – использование ретровирусных векторов, которые позволяют с высокой эффективностью осуществлять трансформацию клеток мишеней как in vitro, так in vivo. Преимуществом ретровирусных систем переноса генов является возмож-

ность получения так называемых соматических трансгенных животных,

т.е. животных с трансформацией клеток отдельных органов и тканей. В основе получения таких животных лежит принцип, используемый в генной терапии. Векторные конструкции, содержащие интересующий ген, вводят непосредственно в органы и ткани взрослых животных. Наличие в генных конструкциях тканеспецифических промоторов обеспечивает экспрессию целевого гена только в определенных тканях.

В качестве примера рассмотрим получение эритропоэтина человека на трансгенных животных.

Для получения эритропоэтина человека были использованы два ретровирусных вектора pLN- и pLN-G-CSF, полученные на основе вируса лейкемии мышей Молони. Обе конструкции были созданы на основе вектора pLNS путем встраивания в прямой ориентации в сайт XhoI геномных последовательностей эритропоэтина человека (pLN- ) под контролем промотора S1-казеина крупного рогатого скота.

Для упаковки генных конструкций в вирусные частицы были использованы два типа пакующих клеток – Gpevn-AM12 и pg13. Обе линии получены на основании эмбриональных фибробластов мыши, в которые последовательно были встроены вирускодирующие последовательности.

Технология получения соматических трансгенных животных включала следующие этапы: выращивание пакующих линий клеток в культуре и их оценку на наличие рекомбинантной ДНК методом ПЦР; введение вирусного препарата (клеток-упаковщиц) в молочную железу взрослых животных; анализ молока подопытных животных на наличие рекомбинантной ДНК и определение в нем уровня экспрессии рекомбинантного про-

183

дукта. Эксперименты по трансформации клеток молочной железы проводили на трех видах животных: коровах, козах, свиноматках.

Введение генных конструкций в клетки молочной железы осуществляли как in vitro, так и in vivo. Трансформацию клеток-мишеней in vitro проводили путем совместного культивирования с клеткамиупаковщицами. Для трансформации клеток молочной железы in vivo использовали суспензию клеток-упаковщиц, которые вводились непосредственно в паренхиму вымени взрослых животных. Учитывая, что ретровирусы способны инфицировать только делящиеся клетки, введение клетокупаковщиц осуществляли в период беременности, когда наблюдается наиболее активная пролиферация клеток молочной железы. Экспрессия рекомбинантного эритропоэтина человека наблюдалась практически у всех видов подопытных животных. Концентрация рекомбинантного эритропоэтина человека в молоке животных составляла до 600–1000 нг/мл. Необходимо отметить, что при введении генной конструкции в кровь среднее содержание рекомбинантного продукта в молоке составляло лишь

5–11 нг/мл.

Аналогично был получен гранулоцит-колониестимулирующий фактор (pLN-G-CSF), количество которого в молоке до 200 нг/мл.

Таким образом, создание трансгенных животных может позволить расширить номенклатуру генно-инженерных биотехнологий, позволяющих получать промышленные количества фармацевтических субстанций.

Хорошо известны готовые инъекционные формы рекомбинантного эритропоэтина человека на основе субстанции под названием Эпоэтинальфа и Эпоэтин-бета, представляющие собой лиофилизированные лекарственные формы для инъекций. Эпоэтин-альфа по биологическим свойствам не отличается от человеческого эритропоэтина, применяется при анемиях, связанных с хронической почечной недостаточностью. Эпоэтинбета применяется при анемиях различного генеза (при хронической почечной недостаточности, у недоношенных новорожденных, химиотерапии злокачественных новообразований) и при подготовке к аутогемотрансфузии.

На фармацевтическом рынке Украины присутствуют препараты рекомбинантного эритропоэтина: «Вепокс» – Эпоэтин-альфа (Wockhardt), «Гемакс» – Эпоэтин-альфа (Sidus-Bio-Sidus), «Рекормон» – Эпоэтин-бета (Roche), «Эпрекс» – Эпоэтин-альфа (Cilag) и др.

184

Контрольные вопросы

1.Какова роль гормона инсулина в организме человека? Опишите структуру гормона.

2.Какие этапы синтеза инсулина в -клетках островковой ткани Вам известны?

3.Опишите историю создания производства природного и рекомбинантного инсулинов.

4.Проведите анализ технологии получения рекомбинантного инсулина и укажите методы межоперационного контроля.

5.Каким образом проводят конструирование плазмиды несущей ген инсулина человека?

6.Что представляют собой тельца включения? Каким образом проводится процесс ренатурации?

7.Какова роль гормона роста (соматотропина) в организме человека? Опишите структуру гормона.

8.Проведите анализ технологии получения рекомбинантного гормона роста и укажите методы межоперационного контроля.

9.Какова роль эритропоэтина в организме человека? Опишите структуру гормона.

10.Опишите линии клеток, используемых для получения эритропоэ-

тина.

11.Какие этапы включат получение трансгенных животных?

12.Проведите анализ технологии получения эритропоэтина и укажите методы межоперационного контроля.

13.По каким параметрам проводят контроль качества гормональных препаратов?

14.Аппаратурно-технологическая схема производства гормонов.

185

ГЛАВА 6. НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ИЗГОТОВЛЕНИИ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

6.1. Биотехнология вакцин

Ни одной медицинской науке человечество не обязано спасением стольких жизней, как вакцинологии. Вакцинопрофилактика доказала свою эффективность как наиболее экономичное средство предупреждения инфекционных болезней. Созданы вакцины против 34-х социально значимых инфекций, что привело к значительному снижению заболеваемости дифтерией, столбняком, корью, туляремией, полиомиелитом и исчезновению оспы.

Основной задачей исследования в области вакцинологии является разработка безопасных и высокоэффективных вакцинных препаратов. Весь путь создания вакцин был возможен только при использовании основных достижений биотехнологической науки – открытие анатоксинов и возможность их получения, создание клеточных культур, аттенуация вирусов и бактерий, выделение и очистка полисахаридов, создание рекомбинантных технологий. Каждое открытие биотехнологии и иммунологии это очередной шаг к созданию новых вакцин, причем, не только для профилактики инфекционных заболеваний. Сегодня вакцины активно используются для лечения ряда заболеваний: аллергических, аутоиммунных, онкологических

идр. Так, например, в Украине зарегистрированы две вакцины для лечения

ипрофилактики онкологических заболеваний: вакцина URO-BCG, применяемая для лечения поверхностного рака мочевого пузыря (производства NVI, Нидерланды) и вакцина Гардасил против вируса папилломы человека, рекомбинантная (производство «Merck Sharp & Dohme B.V.», Нидерланды). Многообещающими являются комбинированные вакцины, обеспечивающие иммунизацию против нескольких инфекционных заболеваний. Совершенствование и развитие производства традиционных вакцин идет параллельно с развитием технологий принципиально новых вакцинных препаратов: ДНК-вакцин; вакцин на основе пептидов; мукозальных и рибосомальных вакцин; создание препаратов, с помощью которых появится возможность влиять на иммунную систему при использовании новых им-

186

муномодуляторов, повышающих иммунный ответ; создание новых систем переносчиков, например, липосом для доставки антигенов или иммуномодуляторов; рекомбинантных вакцин и ряда других.

Интенсивное развитие биотехнологии, биохимии, иммунологии определило прогресс в развитии мировой фармации и создания высокоэффективных вакцин, как традиционных, так и вакцин нового поколения; препаратов крови, интерферонов, цитокинов и рекомбинантных продуктов различной направленности. С развитием технологии рекомбинантных ДНК стало возможным создание вакцин следующего поколения, лишенных недостатков традиционных вакцин.

Вданной публикации невозможно осветить вопросы, касающиеся разработки и производства всех существующих сегодня в мировой практике вакцин. В связи с этим мы остановились только на принципиальных подходах к созданию новых высокоэффективных вакцинных препаратов.

Вэтой главе суммированы основные технологии, ключевые проблемы и иммунологические цели создания различных видов активных вакцин. В наших предыдущих работах были подробно освещены технологии получения основных вакцин действующего в Украине Календаря прививок.

Технологии и примеры, представленные здесь, должны предоставить читателю четкую структуру, которая дала бы ему возможность оценить различные подходы к исследованиям и разработке новых вакцин. Данный раздел настоящего учебного пособия должен рассматриваться совместно с материалами, изложенными в учебном пособии: Краснопольский Ю.М., Борщевская М.И. «Фармацевтическая биотехнология: Технология производства иммунобиологических препаратов».– Харьков, НТУ «ХПИ», 2009.

Втабл. 13 представлен перечень вакцин, полученных с использованием различных технологий.

187