Материал: Фарм производство БАР

Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Наиболее частые осложнения инсулиновой терапии – гипогликемические состояния, что, прежде всего, проявляется в нарушении функций центральной нервной системы (спутанность сознания, кома и др.).

В настоящее время в медицинской практике используют инсулины трех типов:

короткодействующие с быстрым началом эффекта – регулярный инсулин – представляет собой короткодействующий растворимый при нейтральном значении рН кристаллический цинк-инсулин, эффект которого развивается в течение 15 минут после подкожного введения и продолжается 5–7 часов. С целью увеличения длительности действия все другие препараты инсулина модифицированы и при растворении в нейтральной среде образуют суспензию. Они содержат протамин в фосфатном буфере – протамин-цинк-инсулин и НПХ (нейтральный протамин Хагедорна) – НПХ-инсулин или различные концентрации цинка в ацетатном буфере – инсулины ультраленте, ленте, семиленте;

средней продолжительности действия – препараты содержат протамин, представляющий белок средней молекулярной массы 4400, богатый аргинином и получаемый из молок радужной форели. Для образования комплекса требуется соотношение протамина и инсулина 1 : 10. После подкожного введения протеолитические ферменты разрушают протамин, позволяя инсулину всасываться;

длительного действия с медленным проявлением эффекта.

Лечение больных сахарным диабетом I типа включает использование

комбинации препаратов инсулина человека быстрого (короткого) и длительного (пролонгированного) действия. Короткодействующий инсулин должен быстро достигать пика активности в соответствии с подъемом уровня глюкозы, связанным с приемом пищи, и прекращать свое действие после его падения. Инсулин пролонгированного действия, напротив, должен в течение длительного времени обеспечивать определенный базовый уровень глюкозы в промежутках между приемами пищи. Инсулиновая терапия с использованием инсулина имеет ряд недостатков, которые удалось преодолеть только после получения его генно-инженерных аналогов.

170

В настоящее время объем ежегодного потребления в мире субстанции генно-инженерного инсулина человека составляет приблизительно около 30000 кг, а с учетом постоянного роста заболевания диабетом в мире выпуск рекомбинантного инсулина будет увеличиваться ежегодно.

5.2.Производство гормона роста человека (соматотропный гормон)

Гормон роста человека (ГРЧ) – белок вырабатываемый передней долей гипофиза, который секретируется в кровь под воздействием гипоталамического соматостатина и ГРЧ-рилизинг-фактора соматолиберина. Высвобождение гормона регулируется соматостатином, а количество выделяемого ГРЧ определяется соматолиберином. Гормон роста человека относится к группе анаболических гормонов.

Молекула ГРЧ представляет собой одну полипептидную цепь, состоящую из 191 аминокислотного остатка, с молекулярной массой 22,125 кDa. По химической структуре, физическим, химическим и биологическим свойствам ГРЧ сходен с пролактином и плацентарным лактогеном. Молекула ГРЧ содержит 2 остатка триптофана, 2 тирозина и 4 цистеина. Последние образуют в молекуле два дисульфидных мостика, которые формируют две петли – большую, включающую центральный участок аминокислотной последовательности между цистеином-54 и цистеи- ном-165, и малую, находящуюся на С-концевом участке между цистеи- ном-182 и цистеином-189. Пространственную структуру молекулы соматотропина отличает высокая степень упорядоченности. В полипептидной цепи ГРЧ выявлено 4 альфа-спиральных и 3 нерегулярных участка. Высокое содержание в молекуле гормона остатков неполярных аминокислот обуславливает образование в водном растворе димеров и более крупных агрегатов.

Впервые гормон был выделен и очищен в 1963 году из гипофиза, полученного из трупного материала. Дефицит этого гормона приводит к гипофизарной карликовости, частота встречаемости которой оценивается как 10 случаев на 1 млн. человек (среди детей западных стран она составляет 1 на 5000 человек). Гормон видоспецифичен и является единственным

171

средством лечения детей, страдающих от его недостатка. Внутримышечное введение гормона роста человека (10 мг/кг в течение года по три инъекции в неделю) увеличивает рост в течение первого года лечения более чем на 6 см. Для достижения более ощутимых результатов введение гормона необходимо продолжать от возраста 4–5 лет до половой зрелости и далее.

Общего количества фармацевтического препарата, выпускаемого компаниями крупных производителей соматотропного гормона, хватало для лечения лишь одной трети случаев гипофизарной карликовости в развитых странах; Недостаток соматотропина оказался еще более острым с учетом других случаев его применения: незаживающие переломы, ожоги, язвы, нарушение гемопоэза.

Кроме того гормон, выделяемый из трупного материала отличался гетерогенностью. Несмотря на совершенствование выделения и очистки гормона, у 5 % больных, получавших препарат, вырабатывались антитела, которые полностью инактивировали его биологическую активность. Необходимо также отметить, что гипофизарный материал заражен нейротоксическим вирусом с необычайно длительным инкубационным периодом. В связи с этим дети, получавшие соматотропный гормон, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении. Вирус, содержавшийся в препаратах гормона, нередко приводил к летальному исходу. С 1985 г. ВОЗ запрещено применение гормона, выделяемого из человеческих гипофизов.

Рекомбинантный соматотропин, получивший название «Сомат-

рем», стал вторым, (после человеческого инсулина) фармацевтическим препаратом, полученным биотехнологическим путем. Гормон роста человека, биологически чистый и свободный от вирусных загрязнений, впервые был получен в 1980 году фирмой «Genentech». Гормон, синтезированный в генетически сконструированных клетках E. Coli, отличается от гормона, выделенного из гипофиза, дополнительным остатком метионина на NH2-конце молекулы. Гормон обладает биологической активностью нативного гормона и даже большим эффектом, чем гормон роста, выделенный из гипофиза, по-видимому, по причине большей чистоты. У детей, страдающих гипофизарной карликовостью, зарегистрирован прирост 8–18 см в год, что несколько больше эффекта гормона, полученного из гипофиза.

172

На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот. Затем клонировали синтетический полипептид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединяли, затем «подстроили» к паре промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры E. Coli (100000 молекул гормона на клетку). Гормон роста человека, синтезированный в бактериях, обладал нужной молекулярной массой и не связан с каким-либо бактериальным белком, от которого его необходимо было бы отщеплять.

Изменяя аминокислотную последовательность гормона роста человека, т.е. его первичную структуру, посредством модификации кодирующего его гена, в бактериальных клетках можно синтезировать аналоги гормона, очень важные для изучения активных участков молекулы (например, участков, которые стимулируют рост или оказывают действие на неоглюкогенез) и этиологии карликовости на молекулярном уровне.

Используя методы рекомбинантных ДНК, можно синтезировать и другие факторы роста, и факторы дифференцировки тканей, выделив вначале их мРНК, затем получив соответствующие гены. Это относится к соматомедину А (стимулирует фиксацию серы в хряще), образование которого индуцируется соматотропином.

В 1982 году выделен и синтезирован полипептид, состоящий из 44 аминокислотных остатков и обладающий полной биологической активностью гипоталамического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение СТГ-РФ способно компенсировать недостаток соматотропина. Применение СТГ-РФ возможно не только для лечения гипофизарной карликовости, но и при некоторых формах диабета и для ускорения регенерации тканей у людей, получивших сильные ожоги.

Стратегию конструирования новых белков путем замены функциональных доменов или с помощью направленного мутагенеза можно использовать для усиления или ослабления биологического действия белка. Например, нативный гормон роста человека связывается в разных типах

173

клеток, как с рецептором гормона роста, так и с пролактиновым рецептором.

Чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе лечения, нужно исключить присоединение гормона роста человека к пролактиновому рецептору. Поскольку участок молекулы гормона роста, связывающийся с этим рецептором, по своей аминокислотной последовательности лишь частично совпадает с участком молекулы, который взаимодействует с пролактиновым рецептором, удалось избирательно снизить связывание гормона с последним. Для этого использовали сайт-специфический мутагенез, в результате которого произошли определенные изменения в боковых группах некоторых аминокислот (His-18, His-21, Glu-174) – лигандов для ионов Zn2+, необходимых для высокоэффективного связывания гормона роста человека с пролактиновым рецептором. Полученный модифицированный гормон роста человека связывается только со «своим» рецептором. Однако, модифицированные гормоны роста человека пока не нашли применения в клинике.

Представляем технологию получения рекомбинантного гормона роста человека (соматотропного гормона) предложенного российскими учеными института биоорганической химии РАН. Предлагаемый метод получения включает шесть основных стадий: ферментацию, выделение телец включения, ренатурацию, ионообменную хроматографию на носителе Q-Sepharose FF, гидрофобную хроматографию на сорбенте Butyl Sepharose 4 FF и гель-фильтрацию с использованием Sephacryl S-100 HR.

Для создания штамма-продуцента был синтезирован искусственный ген [Met-1]рГРЧ, структура которого была оптимизирована для эффективной транскрипции и трансляции в E. Coli BL21(DE3). Был получен соответствующий штамм-продуцент E. coli BL21(DE3)|pES1-6, обладающий продуктивностью 300 мг целевого белка в 1 литре культуры при выращивании в лабораторных условиях.

174

Биотехнология получения рекомбинантного гормона роста человека (соматотропного гормона).

1. Ферментация.

Культуру E. Coli BL21(DE3), трансформированную плазмидой pES1-6/[Met-1]pГРЧ, выращивали в ферментере 1000 л, заполненную питательной средой (панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, K2HPO4, NaСl, MgSO4) при температуре 37 °С и рН 7,0. Количество посевного материала составляло 2 % от объема питательной среды.

В течение процесса культивирования в ферментер подавали стерильный воздух, водный раствор аммиака и раствор глюкозы. Удельный расход воздуха поддерживали на уровне 0,5 л в минуту. Повышения концентрации кислорода в среде достигали за счет увеличения скорости перемешивания культуральной жидкости. Через 3 часа культивирования добавляли изопропил-тио- -D-галактозид до концентрации 52 мг/л и продолжали процесс еще 3 часа. При индукции с помощью изопропил-тио- -D- галактозида происходил эффективный биосинтез рекомбинантного белка, который накапливался в клетках в виде телец включения. С помощью электрофореза в SDS-ПААГ показано, что через 3 часа после внесения индуктора содержание целевого продукта в клетках продуцента достигало 30 % от суммарного клеточного белка. На процесс ферментации оказывает влияние температура, давление, рН, содержание растворенного кислорода в культуральной жидкости и скорость подачи глюкозы. Одним из важней-

ших параметров процесса ферментации является содержание в среде растворенного кислорода, который позволяет регулировать режимы перемешивания культуральной жидкости, подачи воздуха и глюкозы. Содержание растворенного кислорода в культуральной жидкости определяли с помощью датчиков парциального давления в процентах от максимального насыщения. После чего, клетки, содержащие тельца включения, осаждали сепарированием на сепараторе «Westfalia CSA-19». Сырую биомассу суспендировали в буферном растворе А (50 мМ трис-основание с ЭДТА, рН 7,0) в соотношении 1 : 5 (масса : объем) и разрушали в проточном дезинтеграторе «Gaulin». Для этого суспензию пропускали через дезинтегратор 3–4 раза при давлении 600 атм. После дезинтеграции клеточную суспензию сепарировали на сепараторе «Cepa Z81» при 16000 об/мин. Осадок

175

суспендировали в буферном растворе Б (50 мМ трис-HCl, рН 8,0) и вновь центрифугировали в тех же условиях. Содержание рекомбинантного белка в суммарном клеточном лизате и чистоту телец включения анализировали при помощи электрофореза в ПААГ.

2. Выделение телец включения.

Процесс выделения телец включения из клеток сопровождается формированием димеров и олигомеров целевого белка с образованием ковалентных связей между молекулами. Для получения мономерной формы не всегда достаточно применять только восстанавливающие агенты, такие как дитиотреитол, -меркаптоэтанол и др. Для достижения оптимального результата, как правило необходимо использовать буферные растворы, содержащие детергенты и хаотропные агенты.

Восстановление дисульфидных связей в рекомбинантном белке.

Влажные тельца включения (60 г) суспендировали в 1 л буфера, содержащего 7 М гуанидин-HCl, 20 мМ трис-HCl, рН = 8,0; прогревали в течение 60 минут при 37 °С и затем добавляли 30 мМ дитиотреитола. Продолжали инкубацию в течение 60 минут при 37 °С. Раствор восстановленного белка Met-pГРЧ центрифугировали 60 минут при 10000 g для получения солюбилизата.

Солюбилизацию Met-pГРЧ и телец включения проводят по стандартной методике с применением высоких концентраций хаотропных агентов (7 М гуанидин-HCl, 8 М мочевина) в присутствии дитиотреитола при 37 °С. Максимальная растворимость белка в 8 М мочевине составляла 4–5 мг/мл. В то же время использование 7 М гуанидин-HCl позволило обеспечить наиболее полное растворение телец включения, восстановление дисульфидных связей в молекуле и увеличить концентрацию солюбилизованного Met-pГРЧ до 9–10 мг/мл.

Гель-фильтрация на носителе Sephadex G-25. Раствор восстановлен-

ного Met-pГРЧ (1 л) наносили на колонку BPG (140 х 500 см), заполненную носителем G-25 Fine. Колонку предварительно уравновешивали буферным раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl, и 8 М мочевины, рН = 8,0. Этот же буферный раствор использовали для проведения разделения при скорости потока 120 мл/мин. Содержание белка в элюате измеряли с помощью проточного фотометра при длине волны 280 нм.

176

3. Ренатурация.

Ключевой стадией в процессе получения рекомбинантных белков является стадия ренатурации, в процессе которой денатурированный белок приобретает нативную пространственную структуру, обеспечивающую его биологическую активность.

Раствор белка (Met-pГРЧ, 2 л), полученный после гель-фильтрации, при постоянном перемешивании со скоростью 100–120 мл/мин добавляли к 80 л буферного раствора, содержащего 40 мМ трис-HCl, 10 мМ NаCl, 3 мМ цистеамина, 0,3 мМ цистамина, 0,05 мМ ЭДТА и 0,01 % детергента Brij 35P (Serva), pH = 8,5. Полученный раствор оставляют при 4 °С на 4–6 часов.

В условиях промышленного производства процесс ренатурации необходимо проводить при оптимальном объеме раствора, полученного в результате ренатурации; концентрация белка при этом должна быть максимально возможной. Однако повышение концентрации белка влечет за собой увеличение содержания в реакционной смеси нерастворимых белковых агрегатов. Наиболее интенсивная агрегация Met-pГРЧ происходит в процессе ренатурации при переходе от сильноденатурирующих к слабоденатурирующим условиям. Применение неионных детергентов стабилизирует белок в водном растворе и препятствует образованию агрегатов не ковалентной природы. Известно, что детергент Brij 35P блокирует образование агрегатов ГРЧ в растворе в концентрации, равной критической концентрации мицеллообразования. Твин-80 обладает тем же свойством, но в концентрации превышающей концентрацию мицеллообразования. Поэтому в качестве стабилизатора Met-pГРЧ в процессе ренатурации был вы-

бран Brij 35P.

Для образования нативных дисульфидных связей была использована система буферных растворов, содержащих окислительно-восстановитель- ную пару цистеамин / цистамин в соотношении 1 : 0,1. Оптимизацию условий проводили по нескольким параметрам: степень и скорость разбавления солюбилизата, состав буферного раствора для ренатурации. Процесс вели методом разбавления белка буферным раствором с низкой ионной силой. Процедура ренатурации состояла из нескольких этапов. Сначала растворенный в 7 М гуанидин-хлориде белок с помощью гель-фильтрации пере-

177