Материал: Фарм производство БАР

временным изменением проницаемости мембран клеток микроорганизмов (коферменты через мембраны не проникают) с помощью поверхностноактивных соединений (цетилсульфата натрия) позволяет получать НАД до

6 г/л.

4.7. Витамины в составе лекарственных препаратов

Субстанции витаминов широко используются в составе многих лекарственных препаратов. В качестве примера можно привести данные о том, что в Украине зарегистрировано более 200 лекарственных препаратов, в состав которых входят витамины. Препараты выпускают в нескольких формах: для инъекций, таблетки, капсулы, кремы, аэрозоли и др. Кроме лекарственных препаратов, на рынке представлены средства для косметики и биологически активные добавки, содержащие широкий спектр витаминов. Ряд фармацевтических предприятий специализируются на выпуске данных видов продукции, например, фирма «Unipharm» выпускает серию препаратов «Витрум», содержащих различные витамины. В Украине зарегистрировано более 20 препаратов данной серии. Препараты, содержащие витамины выпускают в виде: монопрепаратов (содержат один витамин, например, инъекционные формы аскорбиновой кислоты в виде 5 % или 10 % растворов; рибофлавин в виде 1 % раствора; пиридоксина в виде 1 %, 2,5 %, 5 % растворов и др.), комплексных препаратов, содержащих 2 и более витаминов.

Приводим состав некоторых комплексных препаратов витаминов:

«Витрум» – состав на одну мягкую желатиновую капсулу: β-каротин (1700 МЕ), α-токоферол (10 МЕ), колекальциферол (67 МЕ), аскорбиновая кислота (40 мг), тиамин (2 мг), рибофлавин (2 мг), пантотеновая кислота (10 мг), пиридоксин (5 мг), фолиевая кислота (133 мкг), цианокобаламин (4 мкг), никотинамид (10 мг), биотин (133 мкг), холин (50 мг).

«Витакап» – состав на одну мягкую желатиновую капсулу: α-токоферол (15 МЕ), колекальциферол (400 МЕ), аскорбиновая кислота (75 мг), тиамин (5 мг), рибофлавин (5 мг), пиридоксин (2 мг), фолиевая кислота (1000 мкг), цианокобаламин (5 мкг), никотинамид (45 мг), ретинол (5000 МЕ).

148

Рибофлавин (витамин В2) – катализатор процессов клеточного дыхания и зрительной рецепции, играет важную роль в образовании ДНК, стимулирует процессы регенерации тканей;

Пиридоксин (витамин В6) – в качестве кофермента принимает участие в метаболизме аминокислот и белков в синтезе нейропептидов;

Цианокобаламин (витамин В12) и фолиевая кислота принимают участие в синтезе нуклеотидов, в процессе эритропоэза необходимы для функционирования нервной ткани и для роста организма;

Никотинамид принимает участие в процессах тканевого дыхания, липидного и углеводного обменах;

Аскорбиновая кислота (витамин С) – играет важную роль в регулировании окислительно-восстановительных процессов, обеспечивает синтез коллагена, принимает участие в синтезе стероидных гормонов и катехоламинов, нормализует проницаемость капилляров, принимает участие

всинтезе гемоглобина, повышает неспецифическую резистентность, обладает антидотными свойствами, оказывает влияние на обмен аминокислот ароматического ряда, метаболизм тироксина, биосинтез инсулина;

Альфа-токоферол (витамин Е) – обладает антиоксидантными свойствами, обеспечивает защиту ненасыщенных жирных кислот в мембранах клеток, снижает агрегацию тромбоцитов, угнетает синтез простагландина Е2, усиливает иммунные реакции, в том числе у пожилых людей;

Ретинол (витамин А) – незаменим для роста и репродукции, регенерации, для процессов роста и формирования костей (профилактика рахита), нормального функционирования органов зрения. В сетчатке ретинол подвергается трансформации в цис-ретинол альдегид, который в реакции с опсином формирует фотопигмент родопсин – жизненно важное соединение для адаптации глаза в сумеречном зрении, повышает резистентность организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды.

Колекальциферол (витамин D3) – регулирует обмен кальция и фосфора в организме;

Пантотенат кальция (витамин В5) – стимулирует образование кортикостероидов. Как составная часть кофермента А, обеспечивающего процессы ацетилирования, участвует в углеводном и жировом обмене,

149

синтезе ацетилхолина. Оптимизирует энергетическое обеспечение сократительной функции миокарда, улучшает процессы регенерации.

Требования к качеству препаратов витаминов изложены в Государственной Фармакопее Украины и Европейской фармакопеи.

Для количественного определения ряда витаминов: α-токоферол (витамин Е), ретинол (витамин А), колекальциферол (витамин D3) и др. введено понятие международный единицы (МЕ). При определении количества выделенного витамина обычно в качестве эталона используют химически чистый препарат с заранее известной величиной концентрации. МЕ – это активность определенного весового количества витамина, принятого за эталон. Ряд витаминов в препарате указывают в весовом количестве (мг): аскорбиновая кислота – витамин С, рибофлавин – витамин В2, тиамин – витамин В1 и др.

Для определения содержания витаминов в лекарственных формах используют методы:

ретинол (витамин А) – спектрофотометрически при длине волны 325 нм или при длине волны 620 нм (цветная реакция с хлоридом сурьмы);

тиамин (витамин В1) – флуориметрически при длине волны

436 нм;

рибофлавин (витамин В2) – флуориметрически при длине волны

440 нм;

пиридоксин гидрохлорида (витамин В6) – спектрофотометрически при длине волны 600 нм (цветная реакция);

цианокобаламин (витамин В12) – используют микробиологический метод, например, с E. coli 113-3 в качестве тест-микроорганизма (определяют диаметры зон стимуляции роста тест-микроорганизма исследуемым препаратом и стандартным образцом);

кислота никотиновая (витамин РР) – спектрофотометрически при длине волны 440 нм (по цветной реакцией);

кислота аскорбиновая (витамин С) – титрометрически;

-токоферол ацетат (витамин Е) – спектрофотометрически при длине волны 520 нм (цветная реакция).

150

Заключение

В последние годы современная биотехнология развивалась необычно динамично, особенно в области создания биотехнологических процессов. Развитие биотехнологического производства витаминов определяется рядом причин.

Важнейшим вопросом является создание и селекция новых высокоэффективных штаммов-продуцентов витаминов. Выделенные штаммыпродуценты витаминов часто вариабельны и нестабильны. Поэтому методом селекции отбирают наиболее перспективные штаммы, а затем проводят отбор индуцированных мутантов. Мутантное действие на микроорганизмы достигается применением различных источников (УФ-лучи, рентгеновские лучи, химические вещества и др.). Весьма перспективным является получение новых витаминов путем создания генно-инженерных продуктов, в частности, рекомбинантных штаммов-продуцентов. Большой эффект может дать технология рекомбинантных ДНК. При помощи генетических манипуляций метаболические реакции, протекающие в разных микроорганизмах можно осуществить в одном из них. Примером такого генноинженерного штамма может быть полученный штамм-продуцент, синтезируемый L-аскорбиновую кислоту. Этот гибрид приобрел способность синтезировать конечный продукт комбинированного метаболического пути.

Усиление продукции пантотената (витамин В5) основано на использовании рекомбинантных микроорганизмов характеризующихся высокой ферментативной активностью и обеспечивающих получение пантотената с высоким выходом.

Постоянно проводятся исследование по поиску альтернативных источников биотехнологического получения витаминов. Так, например, установлено, что микроводоросли Chlamydomonas способны синтезировать тиамин (витамин В1) в количестве 71–90 мг/кг биомассы водорослей по сухому весу, что позволяет считать водоросли альтернативным источником получения тиамина. Установлено, что штамм Saccharomyces oviformis Y-2635, выращенный на среде с использованием геотермальной воды от-

151

личается повышенной внутриклеточной концентрацией водорастворимых витаминов группы В. В ряде случаев для получения витаминов проводят обработку культуры микроорганизмов определенными агентами. Так, например, культура Bacillus natto была обработана расчетным количеством хитозана, отфильтрована, сконцентрирована и высушена. Культивирование проводится в аэробных условиях при 32–34 °С в течение 72–96 часов. Получен витамин К2 в количестве 2 мкг/г сухой массы продуцента.

Необходимо остановится на трансгенных растениях, продуцирующих в качестве вторичных метаболитов витамины. Растения, трансформированные химерным геном, кодирующим фермент биосинтеза витамина Е также является перспективным альтернативным источникам получения α-токоферола.

Развитию производства витаминов также способствуют достижения в создании оригинальных технологических схем с использованием высокотехнологического оборудования. За последние годы предложены биотехнологические установки для производства субстанций витаминов. Так, например, в Европе на разработке таких установках специализируется фирма «Uhde» (Германия). Первоначальное компьютерное моделирование планируемой установки позволяет определить узкие места технологии и упростить расчет реакторов и емкостей. Имитационная модель описывает культивирование клеток с их последующим сбором и переработкой, а также отображают такие функциональные шаги, как подготовка систем CIP/SIP, приготовление вспомогательных и питательных сред, промежуточных продуктов, деактивирования и утилизации. Предложены оптимальные схемы концентрации и очистки полупродуктов, позволяющие получать витамины высокой степени чистоты.

Необходимо становиться еще на одном направлении: создании оригинальных лекарственных препаратов, содержащих витамины, что подразумевает создание как продуктов с новым составом, так и препаратов на основе различных форм, например, наночастиц. Весьма перспективной является липосомальная форма витаминов, открывающая значительные возможности для более эффективного воздействия витаминов на организм че-

152

ловека. Сегодня известные липосомы, содержащие как водорастворимые (витамин С и группа витаминов В), так и жирорастворимые (витамины А и Е) витамины. Преимуществом липосомальной формы является их легкое проникновение в кожу. Липосомы быстро усваиваются, взаимодействуя с фосфолипидами клеточных мембран, обогащая кожу липидами и высвобождая витамины, например, ретинол, α-токоферол, коэнзим Q10. Указанные вещества в липосомах проникают в кожу на такую глубину, на которую они сами продиффундировать не способны. Например, витамин А способствует обновлению рогового слоя, тем самым активируя регенеративные процессы в клетках. Витамин С в липосомах полностью сохраняет свою активность и хорошо проникает в кожу, стимулирует синтез коллагена, восстанавливает липидный барьер кожи, предотвращает старение кожи. Кроме того, при попадании в организм липосомальные лекарственные формы витаминов обладают выраженным пролонгированным действием по сравнению со свободными формами витаминов. Липосомы, содержащие витамины сливаются с наружной мембраной клеточной стенки и проникают во внутрь. По нашему мнению, в ряде случаев, липосомальная форма витаминов позволит расширить их применение в клинике.

Таким образом, развитие биотехнологических исследований, создание новых штаммов продуцентов витаминов, включая рекомбинантные, разработка технологических схем и производство высокоэффективного оборудования, расширяет номенклатуру лекарственных форм и состав препаратов и даёт возможность увеличения выпуска субстанций витаминов и их готовых лекарственных форм.

153

Контрольные вопросы

1.По каким критериям классифицируют витамины?

2.Какие методы получения витаминов Вам известны?

3.Почему получение витаминов биотехнологическими методами экономически целесообразно?

4.Назовите штаммы бактерий продуцентов витаминов: аскорбино-

вой кислоты, рибофлавина, цианокобаламина и охарактеризуйте их.

5.Укажите роль штаммов пробиотиков в синтезе витаминов.

6.Проведите анализ технологии получения витамина В2 и укажите методы межоперационного контроля.

7.Какие питательные среды используют для культивирования штаммов-продуцентов витаминов (цианокобаламина, рибофлавина, аскор-

биновой кислоты и др.)?

8. Какими фармакопейными методами проводят определение вита-

минов в лекарственных препаратах?

9.Какова роль витаминов в жизнедеятельности организма?

10.В каких лекарственных формах производят витаминные препара-

ты для медицины и ветеринарии?

11. Проанализируйте технологическую схему получения витами-

на D2 – эргокальциферола.

12. Что означает гетероталлизм и какую роль он играет в получении

-каротина?

13. Опишите технологическую схему получения витамина С – аскор-

биновой кислоты.

14.Какими методами проводят очистку и концентрацию витаминов?

15.Укажите основные методы идентификации и контроля препара-

тов, содержащих витамины.

154

ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГОРМОНАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ

5.1. Производство препаратов инсулина

Инсулин – гормон белковой природы, вырабатываемый -клетками островков Лангерганса поджелудочной железы для поддержания гомеостаза глюкозы в крови. Кодируют этот белок 70 % мРНК, выделенных из этих клеток. Недостаток инсулина в крови вследствие приобретенных или наследуемых факторов приводит к заболеванию сахарным диабетом. Это системное заболевание, неизбежно ведет к ухудшению качества жизни, а без лечения – к смерти.

Известно, что человеческий инсулин представляет собой полипептид с молекулярной массой 5808, состоящий из 51-й аминокислоты, которые образуют две полипептидные цепи, соединенные дисульфидными мостиками. Одна цепь, называемая А содержит 21 аминокислоту, вторая цепь – В содержит 30 аминокислотных остатков. Аминокислотный состав цепей видоспецифичен. Пептидные цепи А и В соединены посредством двух дисульфидных мостиков (-S-S-), которые необходимы для проявления гормональной активности инсулином (их разрушение приводит к потере активности). Предшественник инсулина продуцируется внутри -клеток посредством ДНК и РНК-управляемого синтеза. Синтезируется инсулин в виде одноцепочечного предшественника – препроинсулина (107 аминокислотных остатков), содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором цепи инсулина (А и В) соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей. Длинная цепь проинсулина в аппарате Гольджи упаковывается в гранулы, где в результате гидролиза удаляются четыре аминокислоты с образованием инсулина и связывающего С-пептида. Инсулин и С-пептид в эквивалентных концентрациях секретируются в ответ на все стимуляторы секреции инсулина (глюкоза, манноза). После протео-

155

литического отщепления С-пептида образуется инсулин. В гранулах-клеток инсулин депонируется в виде кристаллов, состоящих из двух атомов цинка и шести молекул инсулина. Цинк, концентрация которого в-клетках островков Лангерганса достигает высоких значений, формирует комплексы с инсулином. Инсулин всех позвоночных образует димеры с помощью водородных связей между пептидными группами остатков В24 и В26 двух мономеров, которые при высоких концентрациях гормона, в свою очередь, реорганизуются в гексамеры, содержащие по два атома цинка в каждом. Наличие таких высокоупорядоченных комплексов существенно облегчило изучение кристаллической структуры инсулина. При физиологических концентрациях инсулин находится в мономерной форме.

Сахарный диабет по распространенности и тяжести занимает третье место после сердечнососудистых и онкологических заболеваний.

Учитывая тяжесть заболевания диабетом, становится понятным, почему уже более 100 лет проводятся разноплановые исследования по созданию и изучению препаратов инсулина. В связи с этим представляет инте-

рес история создания лекарственных препаратов инсулина:

1902 г. – русский врач И. М. Соболев установил, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы;

1921 г. – впервые инсулин был выделен из поджелудочной железы

вчистом виде канадскими учеными Бантингом Ф. и Бестом Ч., и применен

вТоронто с высоким эффектом для лечения 10-летнего мальчика, больного диабетом;

1923 г. – фирмой «Eli Lilly» (США) промышленно получен инсулин из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней. Инсулин из крупного рогатого скота обладает несколько большей антигенностью для человека по сравнению со свиным инсулином (из 1200 кг поджелудочной железы возможно получить около 100 г кристаллического инсулина). Инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скота отличается тремя аминокислотами от инсулина человека, свиной – одной аминокислотой. Инсулин, выделенный из поджелудочной железы животных, использовали до начала 80-х годов XX века;

156

1935 г. – Хагедорн Г. Х. в Дании оптимизировал действие инсулина

ворганизме, предложив пролонгированный препарат – протамин-цинк- инсулин (вводили один раз в сутки);

1952 г. – получен гомогенный кристаллический инсулин, называемый однокомпонентным;

1954 г. – английский биохимик Сенджер Г. получил Нобелевскую премию за установление структуры инсулина;

1963–1965 г.г. – тремя коллективами исследователей в США, Китае и ФРГ, а в начале 70-х годов советскими учеными осуществлен синтез обеих цепей и их соединение дисульфидными связями для получения инсулина. Данный метод синтеза не нашел промышленной реализации в связи с низким выходом, высокой ценой и сложностью проведения синтеза полипетидного гормона, состоящего из десятков аминокислотных остатков;

1980 г – датская компания «Novo» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путем ферментативного замещения 30-го остатка аланина в цепи В на остаток треонина. В дальнейшем проводили хроматографическую очистку продукта, чистота которого была не ниже 99 %. Оба инсулина не отличались по активности и времени действия.

Только в конце 50-х, начале 60-х годов ХХ века были выяснены отличия структуры человеческого инсулина от инсулинов животного происхождения, которые вызывали аллергические реакции. Результаты данных исследований легли в основу разработок промышленного получения инсу-

лина человека. В настоящее время основными способами получения инсулина, идентичного человеку, являются полусинтетический и генноинженерный.

Возможность создания человеческого инсулина стала реальной толь-

ко после установления факта, что биосинтез инсулина в -клетках остров-

ковой ткани происходит по следующим основным этапам:

 закодированная информация о структуре инсулина содержится в гене инсулина (участок ДНК) 11-й хромосомы;

157