Материал: Фарм производство БАР

низмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг -каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora – 3–8 тыс. мкг. Разработаны опытные установки как периодического, так и непрерывного действия для синтеза -каротина, основной недостаток которых – высокая стоимость сырья и большая длительность процесса.

Основными продуцентами -каротина являются гетероталлические микроскопические грибы (дрожжи), из них наиболее широкое применение нашли различные штаммы культуры Blakeslea trispora. При гетероталлизме особи различного пола внешне неразличимы, но отличаются по физиологическим и генетическим характеристикам. Гетероталлизм грибов выражен в образовании разнополого женского (+) и мужского (-) мицелия, при слиянии клеток которых образуются зиготы. Мицелий (+)-формы содержит больше -каротина и поэтому окрашен в более яркую желтую окраску, чем мицелий (-)-формы. Но максимальное количество -каротина синтезируется при совместном культивировании (+) и (-) форм, а именно, в 5–17 раз больше, чем при раздельном культивировании этих форм микроорганизмов.

Созданы высокопродуктивные штаммы, способные синтезировать и накапливать до 3000–4000 мг -каротина на 1 л среды (для сравнения:

в1 кг моркови содержится в среднем 60–70 мг -каротина).

ВРоссийской Федерации при производстве -каротина, в основном, используется культуры гриба Blakeslea trispora штаммы (+)МБ и (-)МБ, а также (+)С и (-)С, (+)8А и (-)8А. Эти штаммы способны синтезировать от

2000 до 3200 мг -каротина на 1 л культуральной жидкости. Продуценты могут размножаться половым, бесполым и вегетативными путями. Половое размножение осуществляется при совместном выращивании, бесполое

– спорами, вегетативное – отростками (обрывками) мицелия. Активность культур максимальная при совместном выращивании (+) и (-) форм и зависит от их соотношения, которое подбирается экспериментально в микробиологической лаборатории. В среднем соотношение (+) и (-) форм составляет 1 : 15, т.е. мужская (-)-форма используется с пятнадцатикратным избытком.

138

Установлено, что интенсивный биосинтез и накопление -каротина происходит, в основном, во второй фазе развития, которая характеризуется прекращением роста мицелия, снижением рН среды и уменьшением содержания липидов в культуральной жидкости, вследствие их активной переработки в -каротин.

Технологический процесс производства -каротина, принятый промышленностью, включает следующие основные стадии:

1.Подготовка посевного материала.

2.Приготовление питательной среды.

3.Культивирование.

4.Термолиз и фильтрование мицелия.

5.Сушка и размол биомассы.

6.Приготовление готовой лекарственной формы препарата или по-

лучение кормового препарата микробиологического -каротина. Подготовка посевного материал. Главная особенность подготовки

посевного материала в производстве -каротина – раздельное выращивание (+) и (-) форм микроорганизмов продуцентов, начиная с выращивания на скошенных средах в пробирках и заканчивая посевными аппаратами. Их слияние происходит лишь в реакторе при совместном культивировании.

Исходные музейные культуры представляют собой споровый или вегетативный материал, хранящий раздельно (+) и (-) формы соответствующих штаммов.

В лаборатории их высевают на твердые среды в пробирках. Затем выращивание ведут на жидких питательных средах в колбах (объемом 0,75 л) в стерильных боксах на встряхивающих устройствах. На этой стадии подготовки посевного материала увеличивают примерно в 1,5 раза количество (-)-форм по отношению к (+)-формам. В посевных аппаратах соотношение (+) и (-)-форм достигает уже 1 : 10 т.е. объем аппарата с (-)-формой должен в 10 раз превышать объем аппарата с (+)-формой. При этом состав питательной среды для разных форм одинаковый, режим выращивания обеих форм в посевных аппаратах тоже практически не отличается (температура 28 ± 2 °С, время культивирования от 36 до 72 часов).

Приготовление питательной среды. Основу питательной среды со-

ставляют пшеничная или рисовая мука и растительные масла (хлопковое,

139

кукурузное или подсолнечное). Кроме того, в питательную среду добавляют пеногасители (керосин, ПАВы), антиокислители (бутилоксианизол, лимонную или аскорбиновую кислоты), витамины (тиамин) и стимуляторы синтеза -каротина. В качестве стимулятора наиболее эффективным является -ионон, который можно заменить на более дешевую цитрусовую мелассу. Как заменители -ионона используют изопреновые димеры и тримеры, производные циклогексана, среди которых наибольшую активность проявляет 2,6,6,-триметил-1-ацетилгексан.

Всоставе питательной среды для первой генерации находится: подсолнечный шрот – 8–12 %, меласса 1–2 %, КН2РО4 – 0,05 %, баковый отстой – 4,2–5,0 %, тиамин хлорид – 0,0002 %. До стерилизации вводят биостимуляторы каратиноидообразования – 0,05–0,15 %; антиоксидант 0,03–0,05 %, рН среды составляет 6,0–6,5.

Всоставе питательной среды для второй генерации: мука соевая – 2,3 %, мука кукурузная 4,7 %, КН2РО4 – 0,05 %, рН среды 6,1–6,5. Проводят контроль питательных сред: количество редуцирующих веществ

0,8–3,0 %; азота аминного 70–150 мг, %.

Культивирование проводят 40–48 часов при 26–28 °С и постоянном перемешивании в колбах при 220–240 об/мин. Периодически отбирают пробы для контроля стерильности, рН, количества биомассы.

Стерилизацию питательных сред проводят при 120 °С 30 минут в установках непрерывной стерилизации или непосредственно в аппаратах (инокулятарах, в посевных аппаратах). Учитывая особую чувствительность штаммов Blakeslea trispora к посторонним микроорганизмам, в некоторых случаях после стерилизации в питательную среду добавляют антибиотики для создания гарантированных стерильных условий в процессе культивирования.

Стерильный воздух получают по типовой схеме, характерной для микробиологических аэробных процессов. Как правило, стерилизацию осуществляют в две ступени:

1. Термическая стерилизация за счет подъема температуры воздуха до 200–250 °С при его сжатии в компрессоре;

140

2. Стерилизация в индивидуальных бактериальных фильтрах, установленных на линии подачи стерильного воздуха в барботер каждого биореактора и посевного аппарата.

Культивирование осуществляется в типовых биореакторах вместимостью от 10 до 32 м3, снабженных барботажным устройством, трехъярусной турбинной мешалкой, рубашкой для охлаждения и внутренними теплообменниками для отвода избыточного тепла, выделяемого грибами в процессе своего роста.

Вбиореактор загружают расчетное количество стерильной питательной среды, далее в стерильных условиях из посевных аппаратов подают сначала (-)-форму, а затем (+)-форму в соотношении, указанном инже- нером-биотехнологом (обычно 15 : 1). Выращивание культуры ведут при интенсивной аэрации и перемешивании. Температуру культуральной жидкости (процесс экзотермический) поддерживают в пределах 28 ± 2 °С путем подачи холодной воды в рубашку и теплообменники.

Гашение пены осуществляется обычно механическим пеногасящим устройством, установленным в верхней части вала мешалки. Если уровень пены превышает определенный предел, автоматически включается система подачи стерильного пеногасителя.

Впроцессе культивирования ведут постоянный контроль за ростом

гриба и содержанием -каротина в культуральной жидкости путем отбора проб не реже, чем два раза в сутки.

Содержание биомассы в культуральной жидкости должно находиться в пределах 28–40 г/л, а содержание -каротина – не менее 2000 мг/л. Если эти показатели не достигнуты, в культуральную жидкость добавляют-ионон или другой стимулятор, тиамин, антиокислители и продолжают культивирование до получения положительных результатов.

Термолиз и фильтрация мицелия. По окончании процесса культивирования осуществляют тепловую обработку культуральной жидкости (термолиз) с целью инактивации продуцента и дезактивации ферментов. Для этого нагревают культуральную жидкость острым паром до температуры 85 ± 5 °С и выдерживают при этой температуре не менее 15 минут. Поскольку культуральная жидкость лучше фильтруется в горячем виде, её без охлаждения направляют на пресс-фильтры, где происходит отделение мицелия от нативного раствора. Мицелий представляет собой трудно

141

фильтруемый слизистый осадок, поэтому для его фильтрации применяют сжатый до 3–6 МПа азот.

Мицелий промывают водой и тщательно отжимают сжатым азотом до минимального содержания влаги. Применение сжатого азота или другого инертного газа предотвращает процессы окисления -каротина кислородом воздуха.

Сушка и размол биомассы. Сушку биомассы осуществляют в вакуумбарабанной сушке с ворошителем при температуре 85 ± 5 °С и давлении 0,02–0,01 МПа до содержания остаточной влаги не более 7 %.

Для получения однородного порошка высушенную биомассу перемалывают в мельницах растирающего типа и просеивают через стандартное сито. Дальнейшая переработка сухой биомассы зависит от вида выпускаемой каротинсодержащей продукции.

Кормовой препарат микробиологического каротина представляет собой мелкопластинчатую массу или сыпучий порошок, от оранжевокрасного до красно-коричневого цвета, содержащий не менее 1 %-каротина и не более 7 % влаги. Высушенную, растертую и просеянную биомассу без дополнительной обработки фасуют в полиэтиленовые мешки или барабаны и отправляют потребителю.

Каротин в масле. В эмалированный аппарат-экстрактор помещают сухую тонко измельченную биомассу и -каротина экстрагируют подсолнечным маслом или слабой мисцеллой, образующейся после промывки биомассы на фильтр-прессе. Для интенсификации процесса экстракции применяют роторно-пульсационный генератор.

После экстракции суспензию сжатым азотом подают на фильтрпресс, где отделяют масляный экстракт от шрота, при этом получают концентрированную мисцеллу, содержащую до 1 % -каротина. Шрот на фильтре промывают подсолнечным маслом, тщательно отжимают сжатым азотом и полученную при этом слабую мисцеллу используют для экстракции свежих порций -каротина.

Масляный экстракт (концентрированную мисцеллу) промывают этиловым спиртом, при этом извлекаются органические примеси, придающие экстракту горький привкус. Спирт отделяется от экстракта в делительной воронке и направляется на регенерацию, а экстракт для удаления остатков спирта и летучих примесей выдерживается в вакууме при температуре 35 ± 5 °С и фильтруется для отделения возможного хлопьевидного осадка.

142

Готовый продукт (каротин в масле) представляет собой пищевое подсолнечное масло, содержащее 2–2,2 г/кг -каротина. Его фасуют в жестяные банки по 7 кг или в алюминиевые фляги по 50 кг и направляют на предприятия пищевой промышленности для целевого назначения в качестве пищевой добавки в различные продукты питания (маргарин, сливочные масла различных сортов, хлебопекарская и кондитерская продукция и т.п.).

Кристаллический -каротин. В основе получения кристаллического продукта также используются процессы экстракции -каротина из биомассы продуцента. Раньше экстракцию осуществляли подсолнечным или другими растительными маслами и, после соответствующей обработки экстракта, кристаллический -каротин выделяли путем длительного процесса кристаллизации. При этом выход целевого продукта был невысок и, хотя маточные растворы использовались для получения другого продукта (каротина в масле), потери этого ценного витамина были велики.

Современная технология производства кристаллического -каротина основана на использовании в качестве экстрагента фреона. Этот растворитель весьма избирательно и полно экстрагирует -каротин из сухой биомассы, а затем легко удаляется из экстракта, образуя пересыщенные растворы -каротина в смеси липидов, из которых он кристаллизуется с минимальными потерями. Для удаления органических примесей используется обработка спиртом кубового остатка после отгонки хладона и, чтобы избежать выделение примесей, кристаллизацию ведут при температуре

15 ± 5 °С.

Кристаллический -каротин представляет собой довольно крупные оранжево-красные с фиолетовым отливом кристаллы, температура плавления которых составляет 181–182 °С.

Готовый продукт фасуют в плотно закрытые стеклянные банки темного цвета, обернутые черной бумагой для защиты светочувствительного-каротина.

Потребителями кристаллического -каротина является пищевая промышленность, где он применяется в тех же целях, что и каротин в масле. Кроме того, этот продукт находит применение в медицине и ветеринарии для производства некоторых лечебно-профилактических и витаминных препаратов.

143

4.5. Производство L-аскорбиновой кислоты (витамин С)

Витамин С относится к широко распространенным в природе витаминам. Наиболее важными его источниками для человека служат продукты растительного происхождения: овощи и фрукты. Много витамина С находится в перце, салате, капусте, хрене, рябине, черной смородине и особенно в цитрусовых. Из непищевых источников богаты витамином С шиповник, хвоя и др. Витамин С предохраняет человека от развития цинги. У человека при недостатке витамина С отмечается похудание, общая слабость, одышка, боли в сердце, сердцебиение.

Синтез аскорбиновой кислоты (витамина С) является многоступенчатым процессом, в котором только одна стадия представлена биотрансформацией. Эта стадия трансформации D-сорбита в L-сорбозу при участии ацетатных бактерий. Для получения L-сорбозы используют глубинную ферментацию, когда культуру продуцента Gluconobacter oxydans выращивают в ферментерах периодического режима с мешалкой и барботером (для усиления аэрации) и культивировании продуцента в течение 20–40 часов с результатом по выходу L-сорбозы до 98 % исходного количества сорбита в среде. Обычно для достижения такого высокого выхода целевого продукта в питательную среду вносят кукурузный или дрожжевой экстракт в количестве около 20 %. По окончании ферментации L-сорбозу выделяют из культуральной жидкости. Переход от периодического культивирования продуцента Gluconobacter oxydans к непрерывному в аппарате колоночного типа увеличивает скорость образования L-сорбозы в 1,7 раза. Ферментацию Gluconobacter oxydans проводят на средах содержащих D-сорбит в количестве 20 % при интенсивной аэрации 8–10 литров кислорода в час. Выход L-сорбозы может достичь 98 % за 1–2 суток. При достижении культурой log-фазы можно дополнительно внести в среду D-сорбит до концентрации 25 %.

В настоящее время широкое использование биотехнологических процессов позволяет совершенствовать синтез витамина С, путем сокращения многоэтапных и дорогостоящих химических стадий. Например,

144

синтез аскорбиновой кислоты осуществляется енолизацией его важнейше-

го промежуточного продукта – 2-кето-L-гулоновой кислоты (2-KLG), ко-

торая в кислых условиях превращается в L-аскорбиновую кислоту. Ее,

2-KLG, получают методом двухстадийного микробиологического синтеза,

состоящего из окисления D-глюкозы в 2,5-дикето-D-глюконовую кислоту (2,5-DKG – редуктаза) под действием Acetobacter, Gluconobacter или мутантного штамма Erwinia punctata) и биотрансформации последней под действием Сorynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, синтезирующих фермент 2,5-DKG в 2-кето-L-гулоновую кислоту. При использовании этих микроорганизмов выход целевого продукта составляет около 90 % от исходного количества глюкозы. Предлагаемый метод постоянно совершенствуется за счет совместного культивирования указанных микроорганизмов. Так, например, предложен способ, в котором первоначально штаммы культивировали отдельно на среде следующего состава: D-сорбита – 2,0 %, дрожжевой экстракт – 0,3 %, говяжий экстракт – 0,3 %, кукурузный экстракт – 0,3 %, пептон – 1,0 %, мочевина – 0,1 %, KH2PO4 – 0,1 %, MgSO47H2O – 0,02 %, CaCO3 – 0,1 %; рН среды до стерилизации 7,0–7,2.

Питательную среду стерилизуют при 121 °С в течение 20 минут. Культивирование проводят в течение 24 часов при постоянном перемешивании при 220 об/мин и температуре 30 °С. Полученные культуры вносили в ферментер в количестве 10 % (равные объемы). Состав среды для основного процесса ферментации: D-сорбита – 8,0 %, кукурузный экстракт – 1,0 %,

мочевина – 1,5 %, KH2PO4 – 0,1 %, MgSO47H2O – 0,01 %, CaCO3 – 0,6 %,

пеногаситель – 0,1 %; рН среды до стерилизации 7,0. Питательную среду стерилизовали при 121 °С в течение 20 минут, культивирование проводили при 30 °С и постоянном перемешивании при 180–700 об/мин в течение 96 часов (аэрация до 1 л/мин). В процессе культивирования значение рН поддерживается на постоянном уровне (6,5–7,0) с помощью 4НNа2СО3. Культивирование проводят под контролем накопления 2-кето-L-гулоновой кислоты, которую определяли методом ВЭЖХ. Выход 2-KLG составлял 76,8 % от используемого количества D-сорбита.

145

Одним из перспективных направлений может являться создание одного микроорганизма, синтезирующего все ферменты необходимые для превращения D-глюкозы в 2,5-DKG. Erwinia herbicola осуществляет превращение D-глюкозы в 2,5-DKG в несколько стадий, катализируемых разными ферментами. Для превращения 2,5-DKG в 2-KLG необходима только одна стадия. Следовательно, наиболее простой способ создания одного микроорганизма, способного превращать D-глюкозу в 2-KLG, состоит в выделении гена 2,5-DKG-редуктазы Corynebacterium sp. и введении его в Erwinia herbicola. При помощи генетических манипуляций метаболические реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах, удалось осуществить в одном из них. Этот гибрид приобрел способность синтезировать конечный продукт комбинированного метаболического пути. Такой организм можно использовать как фабрику для производства 2-KLG, заменяющую первые три стадии в процессе получения L-аскорбиновой кислоты, который используется в настоящее время.

На рис. 15 представлен промышленный синтез L-аскорбиновой кислоты. Одна из стадий процесса, а именно превращение D-сорбитола в L- сорбозу, осуществляется при участии бактерии Acetobacter suboxydans, которая синтезирует фермент сорбитолдегидрогеназу. Остальные стадии представляют собой чисто химические реакции.

146