Материал: Барам_Курс лекций ВЭЖХ для ВСЕХ [2007]
ВЭЖХ - 2006
УФ-СПЕКТРОСКОПИЯ
Влияние растворителя
А
R-COO
1.4
1.2
рКа
1.0
R-COOH
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
|
рН раствора |
|
|
||
Величина рН и поглощениe раствора кислоты
рКа=5; С0=0.0001 М; εRCOO-=10000; εRCOOH=15000; l=1 cм
ВЭЖХ - 2006
МАТЕРИАЛЬНЫЙБАЛАНС
ВХРОМАТОГРАФИИ
Концентрация |
ОБРАЗЕЦ |
Хроматография |
ПИК |
|
|||
СS |
|
|
|
|
w |
h |
|
|
|
h |
|
|
|
2 |
|
|
VS |
|
VR |
|
|
Объем |
|
Количество вещества в образце равно количеству вещества в соответствующем ему хроматографическом пике
Qs =Cs Vs =∫C dV
где Qs - количество вещества в введенном в колонкуобразце Сs - концентрация вещества в образце;
Vs - объем образца
С - текущая концентрация вещества в элюате V - текущий объем элюата
75
ВЭЖХ - 2006 |
|
МАТЕРИАЛЬНЫЙБАЛАНС |
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
ВХРОМАТОГРАФИИ |
|
|
|
|||||||
|
ОБРАЗЕЦ |
Хроматография |
ПИК |
Для фотометрического детектора: |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
A=εC l |
|
|
|
|||||
Концентрация |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
As Vs |
= h σ |
2π ≈ 1.06 h w |
||||||
Сs |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ε Cs l Vs |
N |
|
|
||
|
|
|
|
w |
|
|
h = |
|
|
||||||
|
|
|
|
h |
|
h |
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
' |
|
|
|
||||
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
V0 (1 + k ) |
2π |
|
|
||
|
|
Vs |
|
|
|
Vr |
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
As - поглощение раствора образца |
|
|
|||||||
|
|
|
Объем |
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
h - высота пика в единицах оптического поглощения |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
σ - стандартное отклонение гауссова пика |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
w - ширина пика на половине его высоты |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
ε - коэффициент экстинкции вещества |
|
||||||
|
|
2A |
V |
(1 + k' ) |
2π |
l - длина оптического пути измерительной ячейки |
|||||||||
Cмин = |
N - эффективность хроматографической колонки |
||||||||||||||
|
шум |
0 |
|
|
V0 - свободный (мертвый) объем колонки |
|
|||||||||
|
|
|
ελ l Vs |
N |
|
k' - фактор удерживаниявещества |
|
|
|||||||
ВЭЖХ - 2006 |
|
|
СРАВНЕНИЕСПЕКТРОВ |
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
||||||||||
ε |
|
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ |
А |
Хроматограмма |
|
|
ХРОМАТОГРАФИЯ |
|
|||||||
|
|
|
фиксированная |
|
|
2 |
|
|
|
спектры в точках 1, 2 и 3 |
|||||
|
|
|
концентрация |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
λмакс |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
εмакс |
|
|
|
λмакс |
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
λмин |
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
|
|||
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
λмин |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
εмин |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
210 |
|
230 |
250 |
270 |
290 нм |
Объем (Время) |
|
|
|
ХРОМАТОГРАФИЯ |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
нормированные спектры |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
) |
2.0 |
в точках 1, 2 и 3 |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
макс |
1.5 |
|
|
|
|
|
|
R = Aλ |
= ελ C l = ελ |
= const |
А(λ |
|
|
|
|
|||||||
|
1.0 |
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
A0 |
ε0 C l ε0 |
|
А()/λ |
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
λмакс |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
210 |
230 |
250 |
270 |
290 нм |
|
|
|
|
|
|
|
|
76 |
|
|
|
|
|
|
|
ВЭЖХ - 2006
СРАВНЕНИЕСПЕКТРОВ
ПОГЛОЩЕНИЯ
2.5 |
274 |
Нормированные спектры |
|
Спектральные отношения |
||||||
/А |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
210 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2.0 |
А |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
274 |
|
|
|
|
|
|
|
274 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
А/ |
|
274 |
|
/А |
|
|
|
|
|
|
λ |
|
А/ |
274 |
274 |
274 |
|
|
|
|
|
А |
|
230 |
/А |
А |
/А |
|
|
|
|
274 |
1.0 |
|
А |
250 |
|
290 |
|
|
|
|
|
|
|
А |
|
А |
|
|
|
|
А |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
/ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
290 |
0.5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
А |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
210 |
230 |
250 |
270 |
290 нм |
210 |
230 |
250 |
270 |
290 нм |
ВЭЖХ - 2006
МЕТОДВЭЖХВСОВРЕМЕННОМ ОБЩЕСТВЕ
Количество
Важнейшие области применения ВЭЖХ контролируемых веществ
Контроль качества лекарств |
2000 |
Токсикология |
1000 |
Экология |
500 |
Химическая безопасность продовольствия |
500 |
Оборот наркотиков |
300 |
Фармакология |
100 |
|
|
77
ВЭЖХ - 2006
МЕТОДВЭЖХВСОВРЕМЕННОМ ОБЩЕСТВЕ
Аналитическаязадача: определитьконцентрациювещества N иззаданногоспискавеществ
Скрининг
ВЭЖХ - 2006
НЕДОСТАТКИ ВЭЖХ
Отсутствие"универсальных" методиканализа
Каждому веществу - своя "уникальная" методика
Калибровкахроматографапереданализом
Хроматограф - "черный" ящик
Многократноеповторениеанализа
Доверие только к усредненным результатам
78
ВЭЖХ - 2006
НЕДОСТАТКИ ВЭЖХ: фармакопейныйанализ
AMPICILLIN SODIUM
European Pharmacopoeia 1998:0578
Определение основного вещества и примесей:
-колонка 4.6х250 мм с обращенной фазой С18 (5 мкм)
-градиентное и изократическое элюирование (60 мин)
-УФ-детектированиепри λ=254 нм
ВЭЖХ - 2006
НЕДОСТАТКИ ВЭЖХ: фармакопейныйанализ
AMPICILLIN SODIUM
European Pharmacopoeia 1998:0578
1. Приготовление растворов:
элюент А: СН3СООН - 0.2 М КН2РО4 - ACN - Н2О = (0.5:50:50:899.5); элюент В: СН3СООН - 0.2 М КН2РО4 - ACN - Н2О = (0.5:50:400:549.5);
раствор 1: 31.0 мг субстанции в 50 мл элюента А; раствор 2: 31.0 мг субстанции в 10 мл элюента А;
раствор 3: 27.0 мг безводного ампициллина в 50 мл элюента А; раствор 4: 2.0 мг цефрадина в 50 мл элюента А; раствор 5: смесь 1 мл раствора 3 с 20 мл элюента А; раствор 6: смесь 1 мл раствора 5 с 25 мл элюента А; раствор 7: смесь 5 мл раствора 4 с 5 мл раствора №3; раствор 8: смесь 1 мл раствора 3 с 20 мл элюента А);
раствор 9: 200 мг субстанции в 1 мл воды гретьпри 60оС 1 час и смешатьсо 100 мл элюента А).
79