Материал: Біологічна та біоорганічна хімія_Мардашко О.О._ изд. 2008-342 с._ОНМедУ-2012

з’єднуються з Fe3+, що входить у каталітичну ділянку цитохромоксидази. Блокада цього ферменту виключає дихальний ланцюг і клітина гине. У медицині застосовують препарати, що містять Меркурій, Арсен, Бісмут, які неконкурентно інгібують ферменти в клітинах організму або бактерій.

Активні й алостеричні центри ферментів

Експериментально виявлено, що відняття шляхом обмеженого протеолізу певної частини ферментного білка не спричинює втрати каталітичної активності. Це дозволило зробити висновок, що під час ферментативної реакції вступає у контакт із субстратом не вся молекула ферменту, а лише деяка її частина — активний центр ферменту (каталітичний центр). Він являє собою ділянку молекули ферменту, де відбувається зв’язування та перетворення субстрату на відповідний продукт або продукти ферментативної реакції. Активні центри простих ферментів звичайно складаються із залишків амінокислот, що містять карбоксильні групи, аміногрупи, сульфгідрильні групи, оксигрупи й інші хімічні групи, розташовані певним чином, як і самі амінокислоти, в активному центрі ферментів. Активні центри складних ферментів утворюються з коферменту та частини апоферменту, що прилягає до нього. Залишки амінокислот, що входять до складу активних центрів, виконують певну функцію в утворенні структури активного центру ферменту і тому поділяються на 3 основні групи:

1.Каталітичні залишки амінокислот. Ці амінокислоти або їх групи атомів безпосередньо контактують із субстратом і беруть участь у його хімічних перетвореннях (розрив хімічного зв’язку, утворення нового хімічного зв’язку).

2.Контактні залишки амінокислот. Ці амінокислоти або їх групи атомів сприяють формуванню певної структури активного центру, що забезпечує його специфічну спорідненість до субстрату і формування ферментно-субстратного комплексу.

3.Допоміжні залишки амінокислот. Ці амінокислоти або їх групи атомів забезпечують стабільність третинної або четвертинної структури ферменту і тим самим — збереження біологічної (каталітичної) активності ферменту.

Функціональні групи таких амінокислот, як цистеїн, серин і гістидин, мають особливе значення для каталізу. HS-групи цистеїну необхідні для активності багатьох ферментів, що каталізують окисно-відновні реакції. Деякі галогенопохідні (азотисті іприти) блокують сульфгідрильні групи, інактивуючи фермент. Численні реакції сульфгідрильних груп із функціональними групами різноманітних речовин забезпечують їх контакт із багатьма субстратами в процесі утворення ферментсубстратних комплексів, отже, й участь у багатьох каталітичних реакціях. До активних центрів багатьох ферментів (фумаратгідратази, рибонуклеази, ацетилхолінестерази, трипсину) входить гістидин, який містить імідазольне кільце. Цей цикл може утворювати водневі зв’яз-

ки, комплекси з металами, а також ацетильні та фосфорні похідні з різноманітними речовинами. Після руйнування цього гетероциклу шляхом фотоокиснення ферменти (ацетилхолінестераза, хімотрипсин та ін.) втрачають свою активність.

До складу активного центру деяких ферментів входять метали. Метал може відігравати роль зв’язуючої ланки між апоферментом і коферментом, може зв’язуватися з субстратом, на який діє фермент, що сприяє утворенню ферментсубстратного комплексу, отже, впливає на швидкість ферментної реакції.

Окрім активного центру, який є в кожному ферменті, у молекулах багатьох ферментів існує алостеричний центр або центри (від гpeцьк. allos

— інший, stereos — пpocторовий). Алостеричні центри — місце впливу на фермент різних регуляторних факторів. Вони являють собою ділянки (одну або кілька) молекули ферменту, з якими зв’язуються певні (зазвичай низькомолекулярні) речовини, молекули яких не подібні за структурою з субстратом цього ферменту. Ці речовини названі алостеричними ефекторами (модуляторами). До них належать гормони, медіатори нервової системи, продукти ферментативних реакцій (метаболіти) та інші речовини. Приєднання ефектора до алостеричного центру веде до зміни третинної або четвертинної структури молекули ферменту і відповідно — конфігурації активного центру, викликаючи зниження або підвищення активності ферменту. Ферменти, що мають алостеричні центри, дістали назву алостеричних. До них належать ферменти, що каталізують або початкові реакції, які розпочинають великі метаболічні процеси, або реакції «вузлові», розташовані на перетині кількох шляхів. Наприклад, до алостеричних ферментів належать гексокіназа, піруватдегідрогеназа, α -кeтoглyтapaтдeгідpo- гeнaзa та ін.

Підвищення концентрації молочної кислоти, яка є кінцевим продуктом гліколізу, пригнічує активність гексокінази, що каталізує реакцію «запалу» в ланцюгу ферментативних перетворень гліколізу і тим самим загальмовує всю анаеробну фазу. Регулювальний вплив кінцевого метаболіту здійснюється за принципом зворотного зв’язку. Глюкозо-6-фосфат підвищує активність ферменту глікоген-УДФ-глікозилтранс- ферази, що бере участь у біосинтезі глікогену. Нагромадження лимонної кислоти (першого продукту циклу трикарбонових кислот) активує ацетил-КоА-карбоксилазу, що каталізує перетворення ацетил-КоА на малоніл-КоА — початкову реакцію біосинтезу вищих жирних кислот.

Регуляція ферментативних процесів

Існує чотири основних механізми регуляції каталітичної активності ферментів:

1.Алостерична регуляція активності ферментів.

2.Регуляція активності (активування та інгібування) ферменту за допомогою особливих регуляторних білків.

3.Регуляція активності ферментів за допомогою ковалентної модифікації.

4.Активація ферменту за допомогою часткового протеолізу.

Алостерична регуляція активності ферментів

Алостерична регуляція характерна тільки для особливої групи ферментів із четвертинною структурою, що мають регуляторні (алостеричні) центри для зв’язування алостеричних ефекторів. Приєднання алостеричних ефекторів до алостеричного центру молекули ферменту викликає зміну його конформації, що приводить до зміни структури активного центру, а через це — до пригнічення або активації функцій ферменту. Активний і регуляторний (алостеричний) центри локалізуються на різних субодиницях ферменту — каталітичній та регуляторній відповідно. Існують два фізичних стани алостеричного ферменту, які розрізняються своєю конформацією й каталітичною активністю: каталітичний стан

— R (від англ. relax — розслаблений) і інгібований стан — Т (від англ. tensed — напружений). Оборотний перехід між R- і T-станами залежить від взаємодії ферменту з алостеричними ефекторами.

Якщо регуляція дії ферменту здійснюється ефектором (гетеротропні алостеричні інгібітори й активатори), що за хімічною природою відрізняється від субстрату, особливо кінцеві продукти багатоступінчатих процесів, то у цьому випадку продукт (або продукти) метаболічного шляху (звичайно анаболічного) за механізмом негативного зворотного зв’язку інгібує перший фермент послідовності реакцій — відбувається ретроінгібування. Цей тип інгібування є одним із провідних для регуляції активності ферментів і клітинного метаболізму в цілому. Якщо фермент побудований з ідентичних протомерів, то алостерична регуляція може здійснюватися самим субстратом, приєднання субстрату до одного протомера змінює конформацію всього білкаферменту, активність інших протомерів може змінюватися (гомотропна алостерична регуляція), прикладом якої є фосфорилування глюкози гексокіназою. Перше хімічне перетворення глюкози в клітинах — фосфорилування в результаті взаємодії з АТФ. Реакцію каталізує фермент гексокіназа (у скелетних м’язах). Найважливішою властивістю гексокінази є її інгібування глюкозо-6-фосфатом, тобто останній служить одночасно продуктом реакції й алостеричним інгібітором. У печінці міститься фермент глюкокіназа, який також каталізує фосфорилування D-глюкози.

D-Глюкоза Глюкозо-6-фосфат

Гексокіназа має високу спорідненість до глюкози (Km<0,1 ммоль/л), отже, максимум швидкості реакції досягається при низькій концентрації глюкози.

Глюкокіназа відрізняється від гексокінази високим значенням Km для глюкози (близько 10 ммоль/л) і не інгібується глюкозо-6-фосфатом. Якщо врахувати, що глюкокіназа майже повністю зосереджена у печінці й не інгібується високими концентраціями глюкози й глюкозо-6- фосфатом і саме до печінки портальною веною транспортується кров від тонкої кишки, де всмоктується велика кількість глюкози, то можна дійти висновку, що біологічне значення глюкокінази полягає у затримці глюкози печінкою, а у загальному кровообігу вміст глюкози не підвищується.

Дія регуляторних білків

Кальмодулін після зв’язування чотирьох іонів Ca2+ стає здатним до активації великої кількості ферментів. Важливою біологічною системою контролю за ферментативними реакціями є циклічні нуклеотиди, які регулюють активність протеїнкіназ.

Активація протеїнкіназ за допомогою цАМФ

Протеїнкіназа — тетрамер, що складається з двох каталітичних (С) і двох регуляторних (R) субодиниць. Взаємодія чотирьох молекул цАМФ із R-субодиницями (кожна має 2 центри зв’язування з цАМФ) приводить до дисоціації комплексу.

C2R2 + 4 цАМФ 2С + 2R цАМФ

Активовані протеїнкінази можуть фосфорилувати білки-ферменти. Оскільки цей процес оборотний, то підвищення концентрації цАМФ у клітині веде до активації протеїнкіназ, а зниження — до інгібування. Широко розповсюджені білкові інгібітори протеолітичних ферментів, функція яких — запобігання несвоєчасному руйнуванню білків у тканинах і рідинах. У плазмі крові білкові інгібітори протеїнкіназ беруть участь у регуляції згортання крові й фібринолізу.

Ковалентна модифікація ферментів

Активність багатьох ферментів регулюється фосфорилуванням. Активність ферментів у результаті фосфорилування в одних випадках зменшується, в інших — збільшується. Наприклад, у клітинах жирової тканини міститься ліпаза, що існує у двох формах — фосфопротеїну й простого білка. Ці форми можуть взаємно перетворюватися:

О

Ліпаза + АТФ Ліпаза О Р ОН + АДФ ОН

О

Ліпаза О Р ОН + H2O Ліпаза + H3PO4 ОН

Активація частковим протеолізом

Багато ферментів утворюються з неактивних білків (проферментів або зимогенів) у результаті відщеплення частини пептидного ланцюга:

Трипсиноген Ентерокіназа Трипсин + Гексапептид

Відбувається перебудова просторової структури й формується активний центр, тобто неактивний попередник перетворюється на фермент трипсин. Механізм активації шляхом часткового протеолізу найбільш характерний для протеолітичних ферментів (пептидогідролаз). У ході еволюції виробився механізм, який полягає в тому, що протеолітичні ферменти утворюються й зберігаються в неактивній формі проферментів і активуються в потрібний момент. Це пов’язано з тим, що білки, які є субстратами пептидогідролаз, являють собою основу структурно-функціо- нального апарату клітини, нерегульована дія пептидогідролаз могла б бути небезпечною для клітини.

У деяких випадках функціонують цілі каскади послідовних реакцій часткового протеолізу, коли активований попередній фермент у свою чергу активує наступний і т. ін. (наприклад, згортання крові відбувається в результаті каскаду реакцій активації серії ферментів, останній з яких перетворює розчинний білок плазми крові фібриноген на нерозчинний білок фібрин).

Ізоферменти

Оскільки Н-протомери мають більший негативний заряд при pН=7,0–7,9, ніж М-протомери, то ЛДГ1 мігруватиме при електрофорезі до позитивного електрода (анода) з більшою швидкістю, ніж ЛДГ5. Інші ізоферменти займатимуть проміжні позиції. За електрофореграмою ізоферментів ЛДГ можна судити як про топографію патологічного процесу, так і про ступінь ураження органа або тканини. Існування ізоферментних форм ферменту в різних тканинах визначається:

1.Розбіжностями в особливостях метаболізму

врізних органах (ЛДГ: у серцевому м’язі — 35– 38 АТФ; у скелетному м’язі — 2 АТФ). Ізоферменти значно розрізняються за Vmax і Km.

ЛДГ5 активується піруватом у скелетному м’язі

амінокислоти), панкреатин, дигестал, мезим-фор- те.

Ферментні препарати почали застосовувати при лікуванні онкологічних захворювань. Аспарагіназа має антилейкемічну активність, ефективна при лікуванні гострих і хронічних форм лейкозів і лімфогранулематозів. Аспарагіназа порушує метаболізм амінокислоти аспарагіну, необхідної лейкозним клітинам для їхнього розвитку, оскільки пухлинні клітини не здатні синтезувати аміди амінокислот. Дефіцит аспарагіну, у першу чергу, впливає на клітинні мембрани. Лікувальний ефект аспарагінази пояснюється необоротним розпадом аспарагіну.

Лікарські препарати з антиферментною активністю

Розширюється коло лікарських засобів, дія яких пов’язана з інактивацією ферментів — це інгібітори протеолітичних ферментів, широко застосовуваних при лікуванні гострих панкреатитів. Інгібітор трипсину дуже міцно зв’язується з активним центром трипсину, причина утворення такого комплексу в тому, що панкреатичний інгібітор — дуже ефективний аналог субстрату. Як антигеморагічний засіб застосовується амінокапронова кислота, що є інгібітором фібринолізину. До інгібіторів ферментів належить велика група антихолінестеразних препаратів (прозерин, фізостигмін), інгібітори моноамінооксидази (ніаламід), використовувані як психотропні засоби, інгібітори карбоангідрази — як діуретичні засоби (діакарб). Ефективність алопуринолу при гіперурикемії пов’язана з інгібуванням ферменту ксантиноксидази. Застосування тетураму для лікування алкоголізму пов’язане з пригніченням ферменту ацетальдегідоксидази. Природні інгібітори протеїназ (α 1-антитрипсин, α 1-антихімо- трипсин, α 2-макроглобулін) використовують у терапії гострих панкреатитів, артритів, алергійних захворювань, при яких відзначається активація протеолізу й фібринолізу. α 1-Антитрипсин (або α 1-антипротеїназа) — білок плазми крові, що захищає тканини від розщеплення еластазою, яка секретується нейтрофілами. Антиеластаза — більш точна назва цього ферменту, тому що він блокує еластазу, зв’язуючись майже необоротно з її активним центром. Генетичні захворювання призводять до порушення структури цього ферменту (заміщення лізину на глутамат у 8-му положенні). Наслідком цього є надлишкове руйнування стінок альвеол легень (руйнування еластичних фібрил й інших білків сполучної тканини), а клінічним проявом — емфізема легень (або деструктивна хвороба легень). Сигаретний дим помітно збільшує ймовірність розвитку емфіземи, оскільки речовини сигаретного диму окиснюють метіонін — інгібітор еластази. Використання ферментів як лікарських засобів завжди здавалося привабливим. Однак їхні властивості: нестабільність, небажані антигенні властивості, пов’язані з білковою природою ферменту (небезпека розвитку алергійної реакції); труднощі до-

ставки до уражених органів і тканин — істотно обмежували можливість їхнього використання. Розробляються методи спрямованого транспорту ферментів, укладених у мікроконтейнери, до зовнішньої поверхні яких можуть бути прикріплені адресні білкові молекули (наприклад, імуноглобуліни — антитіла проти специфічних компонентів органа або тканини-мішені, пухлини).

Іммобілізовані ферменти

Нові перспективи успішного застосування ферментних препаратів відкриває розробка нових лікарських форм — так званих іммобілізованих ферментів. Іммобілізовані, або нерозчинні, ферменти — це штучно отриманий комплекс ферментів із нерозчинним у воді носієм. Іммобілізація (від лат. immobilis — нерухливий) здійснюється шляхом фізичної адсорбції на нерозчинному матеріалі; включенням ферменту в комірки гелю; ковалентним зв’язуванням ферменту з нерозчинним матеріалом або молекул ферменту між собою з утворенням нерозчинних поліферментних комплексів. При одержанні іммобілізованих ферментів уживають усіх запобіжних заходів для збереження активності ферменту.

Іммобілізовані ферменти звичайно менш активні, ніж висхідні, оскільки зв’язування з носієм ослабляє їхній контакт із субстратом. Протеолітичні ферменти (трипсин, хімотрипсин), іммобілізовані на марлевих серветках, тампонах, застосовують у хірургічній практиці для очищення гнійних ран, змертвілих тканин, що грунтується на ферментативному гідролізі білків загиблих клітин у гнійних ранах. Іммобілізовані ферменти стають одними з найпоширеніших ліків біологічного походження. Так, стрептодеказа — це препарат стрептокінази, що належить до «іммобілізованих» ферментів, має пролонговану фібринолітичну дію.

КОНТРОЛЬНІ ПИТАННЯ

1.Ферменти: визначення; властивості ферментів як біологічних каталізаторів.

2.Класифікація і номенклатура ферментів, характеристика окремих класів ферментів.

3.Будова та механізми дії ферментів. Активний та алостеричний (регуляторний) центри.

4.Кофактори і коферменти. Будова та властивості коферментів, вітаміни як попередники у біосинтезі коферментів.

5.Коферменти: типи реакцій, які каталізують окремі класи коферментів.

6.Ізоферменти, особливості будови та функціонування, значення в діагностиці захворювань.

7.Механізми дії та кінетика ферментативних реакцій: залежність швидкості реакції від концентрації субстрату, рН, температури.

8.Активатори й інгібітори ферментів: приклади і механізми дії.