Материал: Біологічна та біоорганічна хімія_Мардашко О.О._ изд. 2008-342 с._ОНМедУ-2012

піруваткарбоксилази, що каталізує перетворення пірувату на оксалоацетат.

2)Коферменти — фосфорні ефіри вітамінів.

До них належать тіамінпірофосфат (ТПФ), піридоксальфосфат (ПАЛФ), піридоксамінфосфат

(ПАМФ). Тіамінпірофосфат входить до складу таких ферментів, як піруват та α -кетоглутарат- дегідрогеназний комплекси, транскетолаза. Коферменти ПАЛФ і ПАМФ є фосфорними ефірами

вітаміну В6, вони входять до складу амінотрансфераз, що каталізують оборотне перетворення амінокислот на кетокислоти. Піридоксальфосфат

єкоферментом декарбоксилаз, що каталізують утворення біогенних амінів з амінокислот.

3)Коферменти-нуклеотиди — ця група ко-

ферментів поділяється на дві підгрупи: кофермен- ти-мононуклеотиди і коферменти-динуклеотиди.

а) До коферментів-мононуклеотидів належать АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ і ФМН. Як кофермент АТФ входить до складу таких ферментів, як гексокіназа і гліцеролкіназа. Перший каталізує перенос фосфату від АТФ на гексози з утворенням фосфорних ефірів гексоз. Гліцеролкіназа каталізує перенос фосфату з АТФ на гліцерол з утворенням активної форми гліцерол-3-фосфату. Так само АТФ є коферментом ферментів аміноацилсинтетаз, що каталізують перенос АМФ від АТФ на амінокислоту з утворенням аміноациладенілатів — активної форми амінокислоти, необхідної в процесі біосинтезу білка. Також АТФ є коферментом ферментів, які каталізують перенос аденозину з АТФ на метіонін з утворенням активної форми метіоніну — S-аденозилметіоніну; ГТФ бере участь у біосинтезі білків, ЦТФ — у біосинтезі фосфоліпідів, УТФ — у біосинтезі глікогену; ФМН є коферментом оксидази альфа-аміно- кислот і НАДН-дегідрогенази, cкладається з pибoфлaвіну і залишку фocфopнoї киcлoти.

б) Коферменти-динуклеотиди. До них належать НАД+, НАДФ+, ФАД і коензим А. Одним із мононуклеотидів усіх цих коферментів є аденозинмонофосфат. Другою частиною цих коферментів є специфічний нуклеотид, у якому азотиста основа представлена відповідним вітаміном.

Кoфepмeнт HAД+ — нікотинамідаденіндинyклeoтид — складається з двоx мoнoнyклeoтидів: пepший — aдeнілoвa киcлoтa, другий — aмід нікoтинoвoї киcлoти, pибoзa та фocфaт. Обидва мoнoнyклeoтиди з’єднані між собою залишками фocфорної кислоти. Нікoтинaмідaдeніндинyклeoтидфocфaт (HAДФ+) тaкож є динyклeoтидoм, але містить у cвoєму складі нe двa, a тpи залишки фocфopної кислоти.

Коферменти НАД+ і НАДФ+ здатні оборотно приймати електрони і протони, тому вони входять до складу дегідрогеназ. Окиснені форми коферментів у реакціях позначають НАД+, НАДФ+, а відновлені — НАДН+Н+ і НАДФН+Н+. Усі фepмeнти, що містять як кoфepмeнт HAД+ чи НAДФ+, звутьcя нікoтинaмідними (піpидинoвими) фepмeнтaми, їx відомо більше 150. Taк,

HAД+ вxoдить до складу тaкиx фepмeнтів, як піpyвaтдeгідpoгeнaзa, α -кeтoглyтapaтдeгідpo- гeнaзa, лактaтдeгідpoгeнaзa, β -гідроксіацил-

KoA-дeгідpoгeнaзa, гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа та ін.; НАДФ+ як кoфepмeнт вxoдить до складу глюкoзo-6-фocфaтдeгідpoгeнaзи, ізoцитpaтдeгідpoгeнaзи та ін.

Флaвінaдeніндинyклeoтид (ФAД) складається з aдeнілoвoї киcлoти та ФМН (флaвінмoнoнyклeoтиду), які з’єднані між coбoю піpoфocфaтним з’язком. Ферменти, до складу яких вxoдить ФAД чи ФМН, нaзивaютьcя флaвінoвими фepмeнтами (флaвoпpотеїнами). Особливістю коферментів ФМН і ФАД є здатність до реакцій окис- нення-відновлення. Найважливішими ферментами, що містять кофермент ФАД, є піруват та α - кетоглутаратдегідрогеназний комплекси, ацил- КоА-дегідрогеназа, сукцинатдегідрогеназа.

Koензим A, чи кoфepмeнт A (KoA), складається з aдeнілoвoї киcлoти і пaнтoтeїну, які з’єднані між coбoю піpoфocфaтним зв’язком, пaнтoтeїн — з вітaміну пaнтoтeнoвoї киcлoти, мepкaптоетилaміну та залишку фocфopнoї киcлoти. Коензим А є коферментом у піруват і α -кетоглутарат- дегідрогеназному комплексах, бере участь в утворенні активних форм жирних кислот — ацилКоА.

4) Коферменти — металовмісні комплекси. До них належать ферумпорфіринові комплекси, інші металовмісні коферменти. Головною складовою частиною ферумпорфіринових комплексів є 4 пірольних кільця, зв’язані із Ферумом. Ферумпорфіринові комплекси входять до складу таких ферментів, як цитохроми, каталаза, пероксидаза. Цитохроми — ферменти тканинного дихання, що каталізують передачу електронів на кисень. Каталаза перетворює пероксид гідрогену на воду та кисень. Пероксидаза також каталізує перетворення перекису гідрогену за участю атомів Гідрогену. До металовмісних ферментів належать ксантиноксидаза (молібденфлавопротеїн, що каталізує окиснення ксантину до сечової кислоти), церулоплазмін і цитохромоксидаза (купрумвмісні протеїни) каталізують реакції окиснення, карбоангідраза — цинковмісний фермент та ін.

6.3. МЕХАНІЗМ ДІЇ ТА ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ. КІНЕТИКА

Швидкість хімічних реакцій залежить: а) від концентрації реагуючих речовин; б) від ступеня хімічної спорідненості реагуючих речовин; в) від кількості активних молекул реагуючих речовин. Якщо у лабораторних умовах можна змінювати концентрацію сполук, підбирати сполуки, які вступають до хімічної реакції, збільшувати кількість активних молекул (наприклад нагріванням), то в біологічних системах, зокрема в клітинах, всі перелічені умови має виконати фермент, що бере участь у реакції. Молекули субстрату, що знаходяться в середовищі у певній концентрації, адсорбуються на поверхні ферменту, особливо біля його активного центру, при цьому концентрація молекул субстрату на фер-

менті багаторазово збільшується. У формуванні ферментсубстратного комплексу беруть участь водневі зв’язки, електростатичні та гідрофобні взаємодії, ковалентні та координаційні зв’язки. Індукована відповідність субстрату та ферменту створюється зміною конформації білкової молекули, геометричною й електронно-топографічною перебудовою молекули субстрату.

Ферменти прискорюють реакції за рахунок зниження енергії активації, яка необхідна для переходу молекул речовин у активний стан. Якщо для перебігу хімічної реакції між сполуками А і В потрібно витратити певну кількість енергії Е, то утворення ферментсубстратного комплексу потребує енергії Е1, а сполучення А і В за участю ферменту потребує енергії Е2, що сумарно значно менше, ніж Е.

А+ В →Е АВ

А+ Ф Е→ 1 АФ

АФ + В →Е2 АВ + Ф Е1 + Е2 < Е

Так, каталаза знижує енергію активації з 77,8 до 22,5 кДж/моль, тобто більш ніж утричі.

Основною умовою ферментативної реакції є те, що для здійснення свого впливу фермент повинен з’єднатися з субстратом. Після утворення ферментсубстратного комплексу субстрат перетворюється на продукт реакції та вивільняється, а фермент повертається у вихідний стан. Швидкість реакції вимірюється кількістю продукту, що утворюється під впливом ферменту (або кількістю субстрату, що прореагував) за одиницю часу. Швидкість ферментативних реакцій залежить від впливу зовнішніх умов (температура, рН середовища, вплив природних і чужорідних сполук тощо).

Основи кінетики ферментативних реакцій були закладені в роботах Міхаеліса і Ментен (1913). Швидкість ферментативної реакції є мірою каталітичної активності ферменту (позначається просто — активність ферменту).

Шляхи визначення ферментативної активності: а) за кількістю субстрату, перетвореного за одиницю часу (пепсин, трипсин); б) за кількістю продукту реакції, утвореного за одиницю часу (ліпаза); в) за часом, необхідним для перетворення певної кількості субстрату (амілаза).

Залежність швидкості каталізу від концентрації субстрату й ферменту

Етапи реакцій:

а) взаємодія ферменту (Е) і субстрату (S), утворення проміжного ферментсубстратного комплексу (ЕS). Слід зазначити, що кожна хімічна реакція має свою константу швидкості (k+1). Але не всі 100 % молекул ферментсубстратного комплексу, що утворилися, візьмуть участь у подальших перетвореннях. Певна частина із них дисоціює з константою швидкості, характерною для кожної реакції (k–1). Кількість утворених молекул ферментсубстратного комплексу залежатиме від співвідношення (k+1)/(k–1);

б) перетворення ферментсубстратного комплексу і перебіг хімічної реакції відбуватиметься також із певною швидкістю, характерною для кожної реакції (k+2);

в) дисоціація комплексу і відділення продуктів реакції від ферменту. Таким чином, кожна реакція має певне співвідношення між константами швидкостей «прямої» реакції утворення ферментсубстратного комплексу, «зворотної» реакції його дисоціації та реакції розпаду на фермент і продукт реакції (рівняння Міхаеліса — Ментен):

k-1 + k-1 , Кm = ————

k-1

де Кm — константа Міхаеліса (концентрація субстрату, при якій швидкість реакції дорівнює половині від максимальної).

Графічне зображення рівняння Міхаеліса — Ментен показує залежність швидкості реакції від концентрації субстрату (рис. 6.2):

V

Vmax

Реакція нульового порядку, швидкість не залежить від [S]

1/2Vmax Реакція першого порядку, швидкість залежить від [S]

Рис. 6.2. Залежність швидкості реакції від концентрації субстрату

вання у свою чергу поділяють на конкурентне й неконкурентне — залежно від того, чи можливо відновити активність ферментативної реакції шляхом збільшення концентрації субстрату. Конкурентним інгібуванням називається гальмування ферментативної реакції, спричинене зв’язуванням інгібітора з активним центром ферменту, інгібітор і субстрат, будучи подібними за будовою, конкурують за активний центр ферменту. З активним центром зв’язується та сполука, молекул якої більше (рис. 6.4).

Рис. 6.4. Конкурентне інгібування ферментів: 1 — графік Лайнуївера — Берка без інгібітора;

2 — графік Лайнуївера — Берка в присутності конкурентного інгібітора

При конкурентному типі інгібування інгібітор збільшує значення Kmi, не впливаючи на макси-

мальну швидкість Vmax. Це означає, що при досить високій концентрації субстрату [S] інгібітор

витісняється молекулами субстрату з комплексу EI. Класичним прикладом подібного типу інгібування є вплив різних речовин на активність сукцинатдегідрогенази — ферменту циклу Кребса. Його природним субстратом є сукцинат, а подібним до нього конкурентним інгібітором — оксалоацетат, проміжний продукт того ж циклу Кребса.

Аналогічним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази є малонова кислота, що часто використовується в біохімічних дослідженнях.

O

Сукцинат Оксалоацетат

Метод конкурентного інгібування знайшов широке застосування в медичній практиці:

Для лікування деяких інфекційних захворювань, викликаних бактеріями, застосовують сульфаніламідні препарати. Виявилося, що ці препарати мають структурну подібність із параамінобензойною кислотою, яку бактеріальна клітина використовує для синтезу фолієвої кислоти, що є складовою частиною ферментів бактерій. Завдяки структурній подібності сульфаніламід блокує дію ферменту шляхом витиснення параамінобензойної кислоти з комплексу з ферментом, що синтезує фолієву кислоту.

Неконкурентним інгібуванням ферменту називається гальмування, пов’язане з впливом інгібітора на каталітичне перетворення, але не на зв’язування субстрату з ферментом. Неконкурентний інгібітор може зв’язуватися безпосередньо з каталітичними групами активного центру ферменту або з ферментом поза активним центром, що заважає взаємодії з субстратом. Дія неконкурентних інгібіторів не усувається додаванням надлишку субстрату.

У присутності інгібіторів такого типу частина ферментів інактивується, швидкість реакції (зокрема максимальна швидкість) зменшується, але константа Міхаеліса залишається без змін.

Неконкурентне інгібування може бути оборотним і необоротним. При оборотному неконкурентному інгібуванні субстрат S й інгібітор I зв’я- зуються з різними центрами, тому з’являється можливість утворення як комплексу EI, так і комплексу EIS; останній може розпадатися зі звільненням продукту, але з меншою швидкістю, ніж комплекс ES (рис. 6.5).

1/Vі

1/Vmax

Рис. 6.5. Неконкурентне інгібування ферментів: 1 — графік Лайнуївера — Берка без інгібітора; 2 — графік Лайнуївера — Берка в присутності неконкурентного інгібітора

До неконкурентних інгібіторів належать іони важких металів (Меркурію, Плюмбуму, Кадмію, Арсену) і їхні органічні сполуки. Вони блокують, наприклад, SH-групи (цистеїну), що входять у каталітичну ділянку ферменту. Неконкурентними інгібіторами є, наприклад, ціаніди, які міцно