Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

Концентрація вітаміну B12 визначається методом дифузії в агар з використанням культури Е.соli 113-3 і спектрофотометричним - принцип якого полягає в трансформації коферменту B12 в кобаламін нітрит. Концентрація кобаламіну визначається на спектрофотометрі при довжині хвилі 361 нм. Для підтримки штаму використовують агаризовані середовища з мелясою наступного складу, г/л: меляса - 100,0, амоній фосфорнокислий двозаміщений – 1,5, сірчанокислий амоній – 0,3, агар – 20, 0, рН - 7,0-7,2. Фізіолого-біохімічні ознаки: не гідролізуює желатин, крохмаль, гідролізує лецитин. Як джерело вуглецю засвоює сахарозу, бетаїн, не засвоює глюкозу, асимілює глутамінову, пропіонову кислоти. Ріст при 42oС варіює. Денітрифікація варіює. Зберігання культури - зберігають штам у вигляді ліофильно-висушеної культури при температурі 4oС протягом 2-3 років або на щільних середовищах при постійних пересівах.

Умови біосинтезу вітаміну В12 штамом Pseudomonas fluorescens.

Біосинтез вітаміну В12 культурою Pseudomonas fluorescens здійснюється за наступною схемою:

→посівна культура на агаризованому середовищі

→посівна культура на колбах на рідкому середовищі

→культура на рідкому середовищі в посівному апараті

→біосинтез на рідкому середовищі у ферментері.

Хід роботи:

1.Для отримання посівного матеріалу для засівання посівних апаратів використовують середовище наступного складу: меляса – 6-12%, двоосновний фосфат амонію - 0,01-0,1%, кобальт хлористий – 0,001- 0,003%, магній сірчанокислий - 0,1-0,3%, марганець сірчанокислий – 0,01- 0,05%, цинк сірчанокислий – 0,002-0,02%, 5-6-діметілбензілімідазол –

0,001-0,003%, вода – до 1000 л, рН середовища – 7,0 0,2 од.

2.У колбу об'ємом 750 мл з об'ємом середовища 50 мл вносять

культуру з пробірки в кількості 0,1%. Вирощують культуру при температурі 30oС протягом 48 годин на качалці. Отриманою культурою в дозі не менше 0,1% засівають стерильне живильне середовище в посівному апараті наступного складу: меляса - 6-12%, двоосновний фосфат амонію - 0,01-0,1%, кобальт хлористий - 0,001-0,003%, магній сірчанокислий - 0,1- 0,3%, марганець сірчанокислий - 0,01-0,05%, цинк сірчанокислий - 0,002- 0,02%, 5-6-диметилбензилімідазол - 0,001-0,003%, вода - до 100%, рН середовища - 7,0 0,2 од.

3.Умови ферментації: постійне перемішування, температура 2832oС, при подачі повітря 02-05 л/ л середовища за хв. протягом 40-60 годин до оптичної щільності більше 0,2.

4.Отриманим посівним матеріалом засівають стерильне ферментаційне середовище наступного складу: меляса - 14-20%, сахароза - 2,0-5,0%, гліцерофосфорна кислота - 0,2-0,4%, кобальт хлористий - 0,01-

186

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

0,03%, холінхлорид - 1,0-2,0%, магній сірчанокислий - 0,1-0,3%, окис магнію - 0,05-0,07%, сірчанокислий амоній - 0,2-0,4%, цинк сірчанокислий - 0,05-0,1%, хлористий кобальт - 0,01-0,02%, 5-6-диметилбензилімідазол - 0,01-0,02%, гліцерин - 0,1-0,2%, вода водопровідна - до 100%, рН середовища - 7,0 0,2 од.

5.Ферментацію проводять при температурі культуральної рідини 2832oС, при постійному перемішуванні, надмірному тиску 0,5 атм, при витраті повітря 0,2 л/л середовища в хв. Культура Pseudomonas fluorescens BKM У-2224Д характеризується тим, що її ріст відбувається паралельно з

біосинтезом вітаміну В12 в аеробних умовах протягом всього процесу ферментації.

6.Вміст вітаміну В12 в культуральній рідині до кінця ферментації становить 120-150 мкг/мл при визначенні мікробіологічним методом з використанням в якості тест-культури Е.соli 113-3 або спектрофотометричним методом. При культивуванні пропіоново-кислих бактерій вміст вітаміну B12 в культуральній рідини дорівнює 40-50 мкг/мл.

7.По закінченні процесу ферментації культуральну рідину підкисляють сірчаної кислотою до значення рН 5,8 од., проводять лізис культури. Для отримання готового продукту культуральна рідина може бути перероблена на розпилювальній сушарці з наповнювачами (крейда, сіль, висівки та ін.)

або відправлена на стадії отримання і виділення вітаміну B12 в чистому вигляді. Результати перевірки рівня біосинтезу вітаміну B12 культурою Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д в лабораторних умовах наведені в табл.28.

Результати перевірки рівня біосинтезу вітаміну B12 культурою Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д в дослідно-промислових умовах (в апаратах об'ємом 2,5 м3) наведені в табл. 29.

РОЗДІЛ 9. МЕТОДИ КОНТРОЛЮ ТА УПРАВЛІННЯ БІОТЕХНОЛОГІЧНИМИ ПРОЦЕСАМИ

РОЗДІЛ 9. МЕТОДИ КОНТРОЛЮ ТА УПРАВЛІННЯ БІОТЕХНОЛОГІЧНИМИ ПРОЦЕСАМИ

Про ріст мікроорганізмів у природних субстратах або в живильних середовищах судять по зміні кількості їх клітин або біомаси в одиниці об'єму. Методи визначення цих показників можуть бути прямими (підрахунок клітин під мікроскопом, зважування) або непрямими. Непрямі методи засновані на вимірюванні параметрів, величина яких залежить від кількості або біомаси мікроорганізмів (число колоній, що виросли після посіву суспензії клітин на живильне середовище, розсіювання або поглинання суспензією світла, вміст у ній білка і т.д.). Вибір методу залежить від цілей дослідження, властивостей поживного середовища або субстрату, а також особливостей росту і морфології мікроорганізмів. Так, багато методів, що використовують для визначення числа одноклітинних мікроорганізмів, неприйнятні при підрахунку багатоклітинних (нитчастих, міцеліальних та інших форм).

При оцінці чисельності мікроорганізмів, особливо в природні субстратах (насамперед у грунті), необхідно пам'ятати, що їх клітини часто знаходяться в прикріпленому (адгезованому) стані або у вигляді мікроколоній. Тому перед початком підрахунку їх потрібно відокремити від часток субстрату і один від одного (десорбувати). Вибір методу десорбції (механічне перемішування суспензії клітин, розтирання, обробка ультразвуком, застосування поверхнево-активних речовин і т.д.) визначається особливостями досліджуваного субстрату.

Робота № 44. Методи кількісного підрахунку мікроорганізмів

Підрахунок клітин у рахункових камерах рекомендується використовувати для підрахунку великих об'єктів - дріжджів, одноклітинних водоростей, конідій грибів і деяких великих бактерій. Зазвичай використовують камеру Горяєва, хоча можна застосовувати й інші рахункові камери. Підрахувати клітини мікроорганізмів під мікроскопом можна, використовуючи рахункові камери, капіляри Перфильєва, препарати фіксованих і пофарбованих клітин, приготовлені на предметних скельцях або мембранних фільтрах. Перераховані методи дозволяють визначити загальну кількість клітин в одиниці об'єму. Варто пам'ятати, що підраховуються всі клітки, як живі, так і мертві. Основне обмеження більшості зазначених методів - необхідність досить високих концентрацій клітин в одиниці досліджуваного субстрату.

Камера Горяєва являє собою прозорий паралелепіпед (предметне скло), з борознами і нанесеною мікроскопічної сіткою (рис.45).

Розміри малих розподілів клітин сітки становлять 0,05 мм, а великих - 0,2 мм. При цьому сітка нанесена на ділянку скла, розташовану на 0,1 мм

188

РОЗДІЛ 9. МЕТОДИ КОНТРОЛЮ ТА УПРАВЛІННЯ БІОТЕХНОЛОГІЧНИМИ ПРОЦЕСАМИ

нижче, ніж дві сусідні ділянки. Ці ділянки служать для притирання покривного скла. У результаті обсяг рідини над квадратом, утвореним великими поділками сітки Горяєва, становить 0,004 мікролітра.

Рис.45. Камера Горяєва

Підрахувавши кількість клітин над великим квадратом, можна підрахувати щільність даного типу клітин в суспензії за формулою:

Кількість клітин/мл = кількість клітин над великим квадратом(N) × 2,5 · 105 .

При роботі з камерою необхідно дотримуватися встановленого порядку її заповнення:

-спочатку поглиблення з сіткою покривають спеціальним шліфованим покривним склом і, злегка притискаючи, зміщують покривне скло в протилежні сторони до появи кілець Ньютона. Ці кільця вказують на те, що покривне скло притерто до сторін камери. Тільки за такої умови обсяг суспензії мікроорганізмів, що знаходиться в камері, відповідає розрахунковому.

-Після цього камеру заповнюють досліджуваною суспензією мікроорганізмів. Суспензію вносять через борозенку камери капіляром або піпеткою.

-Підрахунок клітин рекомендується починати через 3-5 хв. після заповнення камери, щоб клітини осіли і при мікроскопіюванні були видимі в одній площині (рис.46).

Рис.46. Підрахунок клітин

- Число клітин підраховують з об'єктивом 8× або 40×. З імерсійним об'єктивом працювати не можна, тому що його фокусна відстань менше товщини скла камери. Зазвичай підраховують клітини мікроорганізмів в 10 великих або 20 маленьких квадратах сітки, переміщаючи останні по діагоналі. Підраховують всі клітини, що лежать в квадраті сітки, а також клітини, що перетинають верхню і праву сторони квадрата. При підрахунку кількість клітин у великому квадраті не повинно перевищувати 20, а в малому –10, в іншому випадку вихідну суспензію розводять водопровідною водою.

189

РОЗДІЛ 9. МЕТОДИ КОНТРОЛЮ ТА УПРАВЛІННЯ БІОТЕХНОЛОГІЧНИМИ ПРОЦЕСАМИ

Для отримання достовірного результату загальне число підрахованих клітин мікроорганізмів повинно бути не менше 600. Підрахунок клітин повторяють 3-4 рази, кожен раз заново заповнюючи її камеру суспензією мікроорганізмів. Це забезпечує більшу точність, ніж підрахунок 600 клітин при одноразовому підрахунку. Кількість клітин в 1 мл досліджуваної суспензії розраховують за формулою:

де M- число клітин в 1 мл суспензії;

A – середнє число клітин в 1 квадраті сітки; h- висота камери;

S – площа 1 квадрата сітки, мм2;

103 – коефіцієнт переводу кубічних сантиметрів в кубічні міліметри; N – розведення досліджуваної суспензії.

Мета роботи. Освоїти метод підрахунку мікробних клітин в камері Горяєва.

Матеріали та обладнання. Мікроскоп, рахункові камери Горяєва, бактеріологічні петлі, спиртівка, стерильна дистильована вода, чисті культури дріжджів, стерильні піпетки місткістю 1 - 2 мл.

Хід виконання роботи:

1. Приготуйте послідовні 10-кратні розведення вихідної суспензії дріжджів: 10-1, 10-2, 10-3 (до 4,5 мл дистильованої води добавте 0,5 мл суспензії дріжджів).

190