Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

ДОДАТКИ

М’ясо-пептонний бульйон (МПБ):

1.До м’ясної води прибавляють 1% пептону і 0,5% хлориду натрію, кип’ятять протягом 1-2 хв. при помішуванні, потім охолоджують і визначають pH.

2.Внесенням лугу (20%-й NaOH) або 1 н кислоти встановлюють pH середовища 7,6-7,8. Кип’ятять протягом 30-45 хв., охолоджують, фільтрують через паперовий фільтр і доводять об’єм до початкового.

3.Перевіряють pH, доводять його до 7,2-7,4, розливають у колби і стерилізують при 1200 С протягом 15-20 хв.

М’ясо-пептонний агар:

1.До виготовлено й охолодженого МПБ прибавляють 1,5-2,0% агарагару, витримують протягом 15-20 хв. при кімнатній температурі (для набухання).

2.Суміш підігрівають на водяній бані до повного розчинення агарагару.

3.Охолоджують до 500 С і для просвітлення вносять у середовище ретельно збитий, у подвійному об’ємі холодної води, яєчний білок (білок 1 яйця на 1 л середовища). Прогрівають в автоклаві при 0,5 атм протягом 45 хв. Білок адсорбує звішені частинки, згортається й осідає на дно.

4.Середовище фільтрують через шар марлі або вати.

5.Перевіряють і доводять до необхідного значення pH середовища.

6.Середовище розливають у колби і стерилізують при 1200 С (1 атм) протягом 15-20 хв.

Пептонна вода (ПВ):

1.В 1 л дистильованої води розчиняють при нагріванні 100 г пептону, 50 г хлориду натрію, 1 г нітрату калію, і 20 г бікарбонату натрію.

2.Розчин фільтрують через паперовий фільтр, розливають у колби і

стерилізують при 1 атм протягом 30 хв.

Ґрунтовий агар (ГА):

1.З повітряно-сухого ґрунту видаляють рослинні рештки, кусочки скла та інших домішок.

2.Ґрунт розтирають у ступці, а потім просівають через сито з діаметром пор 1 мм.

3.Ґрунт поміщають у колбу і заливають дистильованою водою у співвідношенні 1:5. Суспензію ретельно перемішують, а потім прибавляють 1,5-2,0% агар-агару.

4.Середовище стерилізують в автоклаві при 1200 С протягом 1 год.

Стерилізацію повторюють через 1-2 доби.

Сусловий агар (СА):

1.Пивне сусло розводять до вмісту цукрів 7-80 за Баллінгом і стерилізують при 1200 С протягом 10 хв.

241

ДОДАТКИ

2.В 1 л охолодженого сусла прибавляють 1,5-2,0% агар-агару, витримують при кімнатній температурі протягом 15-20 хв.,

розплавляють середовище на водяній бані, розливають у колби і стерилізують при 1100 С протягом 10 хв.

Середовище Сабуро:

1.В 1 л водопровідної води вносять 80 г пресованих пекарських дріжджів (або 20 г сухих дріжджів).

2.Кип’ятять протягом 15 хв., фільтрують через паперовий фільтр.

3.У холодну дріжджову воду вносять 1,5-2,0% агар-агару і витримують протягом 15-20 хв. при кімнатній температурі, а потім плавлять на водяній бані, прибавляючи 1% пептону і 4% глюкози (або мальтози).

4.Середовище фільтрують через шар вати, розливають у колби і

стерилізують при 0,5 атм протягом 20 хв.

Середовище Чапека:

1.В 1 л водопровідної води внести при перемішуванні:

-глюкозу (сахарозу) - 30,0 г

-натрій азотнокислий - 2,0 г

-калій фосфорнокислий однозаміщений – 1,0 г

-магній сірчанокислий – 0,5 г

-калій хлористий – 0,5 г

-залізо сірчанокисле – 0,01 г

-агар-агар – 20,0 г

2.Середовище стерилізують протягом 10 хв. при 116,50 С (0,75 атм) в автоклаві.

Середовище Ендо:

Поживне середовище Ендо випускається у вигляді сухого порошку і готується згідно пропису, вказаного на етикетці.

Середовище Ешбі:

Для виготовлення синтетичного середовища Ешбі, яке призначене для культивування азотфіксуючих бактерій, на 1 л водопровідної води добавляють:

-калій фосфорнокислий двозаміщений 0,2 г

-магній фосфорнокислий – 0,2 г

-калій фосфорнокислий 0,1 г

-натрій хлористий – 0,2 г

-крейду – 5,0 г

-сахарозу – 20 г

-агар-агар – 20 г.

Крохмале-аміачний агар – найбільш поширене середовище для підрахунку стрептоміцетів в грунті:

-амоній сірчанокислий – 2,0 г

-калій фосфорнокислий двозаміщений – 1,0 г

-магній сірчанокислий – 1,0 г

242

ДОДАТКИ

-натрій хлористий – 1,0 г

-крейду – 3,0 г.

-розчинний крохмаль – 10,0 г

-агар-агар – 20 г

Крохмаль попередньо розмішують у невеликій кількості води, а потім доливають до основного середовища

Цикл перетворень вуглецевмісних сполук складний. У ньому беруть участь мікроорганізми, що розкладають органічні речовини з утворенням різних проміжних і кінцевих продуктів. Ці мікроорганізми відносяться до різних фізіолого-трофічних груп, а їх виділення можливе при висівах матеріалу на середовища, в яких єдиним джерелом вуглецю є органічні речовини.

Серед усієї маси мікроорганізмів, що беруть участь у кругообігу вуглецю, найважливішу роль відіграють оліготрофи, гетеротрофи, дріжджі, стрептоміцети (актиноміцети), мікроміцети (гриби), що розкладають целюлозу, пектинові речовини, жири, вуглеводи.

Олігокарбофіли — одна з найменш вивчених груп мікроорганізмів, життєдіяльність яких забезпечується малою кількістю поживних речовин. Їх виділення і кількісний облік роблять на голодному агарі — агаризованій водопровідній воді, агаризованій воді з досліджуваної водойми чи агаризованому екстракті з ґрунту (дивись нижче). Агар для приготування середовища має бути ретельно відмитий (вилужений). Середовище розливають у стерильні пляшки і автоклавують 20 хв. при тиску 1·105 Па.

Посів роблять глибинним методом заливання в агар, інкубують при температурі не вище 28 °С. Облік і опис колоній роблять через 48-72 год. Колонії оліготрофів поверхневі, дрібні, круглі, а за забарвленням — молочно-білі, сірі чи зовсім безбарвні.

Серед мікробного населення ґрунтів і водойм певне місце займають

бактерії, здатні продукувати біологічно-активні речовини, необхідні для нормальної життєдіяльності біоти. Для вилучення цих мікроорганізмів та встановлення їх кількості надійні результати дає застосування глюкозо-

мінерального середовища Красильникова, яке має такий склад:

243

ДОДАТКИ

Усі солі для приготування цього середовища мають бути марки «чда», глюкоза — в ампулах для ін’єкцій, агар — ретельно відмитим кілька годин у дистильованій воді.

Важливою складовою мікробних угруповань ґрунтів і водних об'єктів є актиноміцети, гриби(мікроміцети) і дріжджі, чисельність яких значно зростає при низькому значенні рН, нестачі азоту і значних запасах органічних речовин. Кількість їх враховують на агаризованих середовищах Чапека-Доксе і середовищі Ваксмана в модифікації Мартинова.

Можна використовувати також елективні середовища з різним джерелом вуглецю, селективні середовища з лігніном, різними інгібіторами бактерій тощо. Зберігати чисті культури до їх ідентифікації

Усі інгредієнти, крім глюкози, розчиняють у дистильованій воді, нагріваючи її текучою парою.

Середовище фільтрують через вату і стерилізують в автоклаві 1 год. при тиску 7·104 Па.

Перед вживанням до середовища додають розчин глюкози, попередньо простерилізований при 100 °С.

Повністю готове середовище стерилізують 30 хв. при 100 °С текучою парою.

Середовище Ваксмана в модифікації Мартинова

(рН 6,3-7,0)

Для приготування ґрунтового екстракту 500 г орного ґрунту або донних відкладень водойми заливають 1200 мл дистильованої води і кип'ятять

244

ДОДАТКИ

протягом 1 год. Фільтрують через вату і доводять дистильованою водою до 1 л, стерилізують в автоклаві 30 хв. при тиску 1·105 Па.

Усі інгредієнти крім глюкози і стрептоміцинсульфату розчиняють у ґрунтовому екстракті й стерилізують в автоклаві 20 хв. при тиску 7·104 Па. Далі чинять так само, як і з середовищем Чапека-Доксе. Перед розливанням у чашки середовище охолоджують до 70 °С і додають стрептоміцинсульфат.

У чашках із середовищем Чапека-Доксе через 28-30 год. підраховують жовто-білі чи жовті опуклі колонії дріжджових грибів і через 7-10 днів колонії цвілевих грибів. Середовище Ваксмана в модифікації Мартинова слугує контрольним, тому що на середовищі Чапека-Доксе ріст

Зазначені інгредієнти додають до дистильованої води і кип'ятять протягом 1 год. Середовище фільтрують через вату і стерилізують 3 дні текучою парою по 30 хв.

При виділенні й кількісному обліку у водоймах дріжджів можуть бути застосовані також інші середовища.

Середовище для дріжджів із суслом і сахарозою (рН 6,8-7,0)

Середовище треба стерилізувати текучою парою або 20 хв. в автоклаві при тиску 7·104 Па.

Середовище для дріжджів із глюкозою (рН 6,8)

245