Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

8.3. Мікробіологічний синтез ціанкобаламіну (вітаміну В12)

Після 10 років досліджень, у яких брали участь понад 100 вчених, повний хімічний синтез вітаміну В12 здійснено у 1973 р. Р. Вудвордтом і А. Ешенмозером. Хімічний синтез досить складний і має 70 етапів, тому на сьогодні основним способом одержання вітаміну В12 є мікробіологічний синтез. Щорічно у світі виробляється понад 10-12 т цього вітаміну. У Росії мікробіологічний синтез вітаміну В12 за допомогою бактерій

Propionibacyerium shermani (патент 1737915) дозволяє досягати концентрацію вітаміну В12 в культуральній рідині на рівні 40-50 мг/л.

Продуценти. Здатність до синтезу вітаміну В12 виявлена у багатьох мікроорганізмів: Agrobacterium, Alcaligenes, Aerobacter, Azotobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Propionibacterium, Protaminobacterium, Proteus, Pseudomonas, Rhizobium, Salmonella, Serratia, Streptomyces, Streptococcus, Xanthomonas (табл.27).

Для промислового виробництва кобаламіну використовують штами, що були оброблені мутагенними факторами (УФ-опромінення, етиленімін, нітрозометилуретан, нітрозогуанідин), а також штами, одержані методами генетичної інженерії. Штам Rhodopseudomonas protamicus одержано злиттям протопластів Protaminobacter ruber і R. sheroides; є інформація про одержання рекомбінантного штаму Pseudomonas denitrificans, здатного синтезувати 100-300 мг/л вітаміну В12.

Примітка. 5,6-ДМБ — 5,6-диметилбензимідазол.

181

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

На сьогодні у світі для одержання вітаміну В12 найчастіше використовуються представники роду Propionibacterium і штами

Pseudomonas denitrificans. Перевагою Propionibacterium є те, що бактерії цього роду отримали статус безпечних для практичного застосування, оскільки не утворюють екзо-, ендотоксинів (висновок Адміністрації харчування і лікарських засобів США).

У Європі віддається перевага штаму Pseudomonas denitrificans як продуцента ціанкобаламіну. Так, цей штам використовується для промислового виробництва вітаміну В12 компанією Aventis (ця компанія утворилася злиттям французької компанії Rhone-Poulenc Rorer і німецької Hoechst AG). Саме співробітниками цієї компанії отримано генноінженерний штам Pseudomonas denitrificans — надсинтетик вітаміну В12, який утворює до 300 мг/л ціанкобаламіну.

Перевагою штаму Pseudomonas denitrificans перед представниками роду Propionibacterium є його здатність до синтезу 5,6-ДМБ (5,6 – диметилбензилімідазол), що виключає потребу у екзогенному внесенні у середовище культивування цього попередника біосинтезу ціанкобаламіну.

Біосинтез вітаміну В12 пропіоновокислими бактеріями відбувається паралельно росту в анаеробних умовах. Вітамін накопичується у клітинах бактерій. Ці особливості враховано у процесі промислового виробництва ціанкобаламіну. Перевагою використання пропіоновокислих бактерій як продуцентів вітаміну В12 є те, що вони синтезують справжній вітамін і переважно у біологічно активній коензимній формі.

Існує два способи одержання вітаміну В12 з використанням бактерій роду Propionibacterium: анаеробний і анаеробно-аеробний. Під час реалізації першого способу (в анаеробних умовах, під тиском азоту) у середовище на другій стадії ферментації (після 72 год.) вносять 5,6-ДМБ. Це зумовлено тим, що 5,6-ДМБ у клітинах пропіоновокислих бактерій синтезується за доступу кисню. У процесі анаеробно-аеробного способу на першій стадії (72-80 год.) штам вирощують в анаеробних умовах (під невеликим тиском азоту і за слабкого перемішування) до повної асиміляції вуглеводів. На другій стадії (80-88 год.) створюють аеробні умови (включають аерацію — 2 м3/год. і перемішування), що забезпечує синтез 5,6-ДМБ. Обидві стадії (анаеробну і аеробну) можна здійснювати в одному або різних ферментаторах.

Робота № 42. Виробництво ціанкобаламіну (вітаміну В12) за допомогою пропіоновокислих бактерій

Середовища культивування. Середовища для культивування пропіоновокислих бактерій і біосинтезу вітаміну В12 зазвичай містять глюкозу чи інвертовану мелясу (10-100 г/л), кукурудзяний екстракт (до 100 г/л), невеликі кількості солей заліза, марганцю і магнію, а також кобальту (10-100 мг/л), джерело мінерального азоту — сірчанокислий

182

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

амоній. У середовище рекомендують вносити також пантотенову кислоту, яка стимулює синтез вітаміну В12.

На початку 90-х років XX ст. науковцями Курганського комбінату медичних препаратів і виробів «Синтез» (Росія) отримано мутантний штам Propionibacterium shermanii 1-63, депонований у Російській колекції промислових мікроорганізмів за номером В-4891 (патент РФ № 1737915, 1994 р). Цей штам отримано ступінчатою селекцією зі штаму М-82 з використанням хімічних мутагенів. Відмінною рисою цього штаму є здатність синтезувати до 40 мг/л вітаміну В12 за умов росту впродовж 120 год. на середовищах зі зниженим вмістом кукурудзяного екстракту.

Матеріали та обладнання: склад середовища для вирощування Propionibacterium shermanii, г/л: глюкоза — 30, лактоза — 10, кукурудзяний екстракт — 70, сірчанокислий амоній — 2, хлористий кобальт — 0,01. Штам культивують у стаціонарних умовах без доступу повітря упродовж 113-120 год., підтримуючи рН на рівні 6,8-7,2 розчином їдкого натру чи аміаку. Через 72 год. у середовище вносять 5,6-ДМБ у кількості 20-34 мг/л.

Хід роботи:

Одержання кристалічного вітаміну В12. Ціанкобаламін накопичується в клітинах бактерій, тому стадії операції з виділення вітаміну такі:

−сепарування клітин;

− екстрагування водою за рН 4,5-5,0 і при температурі 85-90°С за наявності стабілізатора (0,25 % розчину нітриту натрію) - упродовж 1 год. За таких умов вітамін В12 переходить у розчин;

−водний розчин охолоджують, доводять рН до 6,8-7,0 50% розчином

їдкого натру. Для коагуляції білків додають Al2(S04)3х18H20 і безводний FeCl3, після чого осад відділяють фільтруванням;

−розчин очищують із використанням іонообмінних смол СГ-1 (попередньо розчин вітаміну підкислюють до рН 2,5-2,7), після чого кобаламіни елюють розчином аміаку;

−розчин вітаміну додатково очищують органічними розчинниками,

випарюють й очищують на колонці з А1203, після чого кобаламіни елюють водним ацетоном;

− до водно-ацетонового розчину вітаміну додають ацетон і витримують 24-48 год. при температурі 3-4 °С. Кристали вітаміну відфільтровують, промивають безводним ацетоном висушують у вакуумі.

В одному з варіантів одержання кристалічного вітаміну В12 після елюції кобаламінів з іонообмінної смоли СГ-1 в аміачний розчин вітаміну вносять активоване вугілля, десятикратний об'єм води і 0,9 % NaCN до маси вугілля. Після двох годин перемішування масу підкислюють соляною кислотою, вугілля відфільтровують (з обов'язковим промиванням осаду) і

183

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

десорбують із вугілля вітамін ізопропіловим спиртом. Ізопропіловий спирт упарюють і вітамін В12 піддають додатковому резорциновому очищенню кристалізації. Така схема виділення вітаміну була реалізована у Радянському Союзі.

Виділення вітаміну В12:

1.З метою підвищення ефективності вилучення вітаміну з клітин перед екстрагуванням клітини заморожують при температурі -4...-12°С і витримують упродовж 1 год. з наступним відтаюванням.

2.Клітини обробляють 0,5-3 % розчином аніонного детергенту додецилсульфату натрію у лужному середовищі за рН 9-10 упродовж 30 хв. при кімнатній температурі з постійним перемішуванням.

3.Далі центрифугують, осад промивають 0,5 % розчином додецилсульфату натрію, повторно центрифугують.

4.У супернатант додають 2 мг% KCN, перемішують і витримують у темноті упродовж 20 хв. KCN добавляють для переведення кобаламіну у ціанкобаламін.

5.Далі вітамін вилучають багатократним екстрагуванням невеликими порціями фенолхлороформної суміші (1:1). Із суміші вітамін переводять у воду з додаванням 1,5 об'ємів хлороформу і 0,75 об'єму бутанолу. Залишки хлороформу і етанолу видаляють обробленням

етанолом. Беручи до уваги високу світлочутливість вітаміну В12, всі операції технологічного процесу слід проводити у затемнених умовах (або при червоному світлі).

Робота № 43. Виробництво ціанкобаламіну (вітаміну В12) продуцентами Pseudomonas denitrificans та Pseudomonas fluorescens

Періодичне культивування бактерій здійснюють в аеробних умовах (з аерацією — 0,2 м3/год. і перемішуванням — до 420 об/хв.) упродовж 90 год. при температурі 28-29°С.

Для одержання посівного матеріалу використовують середовище такого складу, г/л: бурякова меляса — 60, пивні дріжджі — 1,0, N—Z-амін

—1,0, (NH4)2P04 — 2,0, MgS04 — 1,0, MnS04 — 0,2, ZnS04 — 0,020, MoS04

—0,005; рН 7,4. Тривалість вирощування інокуляту 72 год.

Склад середовища для виробничого біосинтезу, г/л: бурякова меляса

—100, дріжджовий екстракт — 2,0, (NH4)2P04 — 5,0, MgS04 — 3,0, MnS04

—0,2, CoN03 — 0,188, 5,6-ДМБ — 0,025, ZnS04 — 0,020, Na2Mo03 —

0,005; рН 7,4. Меляса багата на бетаїн і глутамінову кислоту, які позитивно впливають на біосинтез вітаміну. Встановлено, що бетаїн стимулює синтез 5- амінолевулинової кислоти — інтермедіату синтезу кобаламінів, а також змінює проникність мембрани.

Виділення вітаміну. Очищений вітамін одержують в результаті проведення таких стадій:

184

РОЗДІЛ 8. ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ ПЕРВИННИХ ТА ВТОРИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

1. Культуральну рідину (3,3 л) нагрівають до 120 °С і витримують при такій температурі 30 хв. Потім охолоджують до 25°С, доводять рН до 8,5, добавляють KCN, витримують (перемішуючи) 16 год., після чого вносять ZnCl2, доводять рН до 8,0, перемішують і фільтрують. У результаті проведених операцій одержують фільтрат, що містить вітамін

В12.

2.З фільтрату вітамін тричі екстрагують сумішшю крезолу і трихлористого вуглецю у співвідношенні 1:2, добавляючи кожного разу суміш екстрагентів у кількості 350 мл. У результаті здійснення таких операцій одержують органічний екстракт вітаміну (органічний екстракт І);

3.До органічного екстракту І добавляють бутанол (500 мл), після чого тричі екстрагують вітамін водою (100 мл) і одержують водний екстракт вітаміну.

4.Суміші крезолу і трихлористого вуглецю у співвідношенні 1:2, у результаті чого одержують органічний екстракт II;

5.До органічного екстракту II добавляють 200 мл ацетону і 120 мл ефіру. Так одержують неочищений вітамін В12.

6.Для одержання очищеного вітаміну неочищений препарат розчиняють у 10 мл метанолу, сорбують на активованому алюмінії (4 г), елюють 2 % розчином оцтової кислоти у метанолі і осаджують ефіром.

Так одержують очищений вітамін В12 (ступінь очищення 98 %). Вихід ціанкобаламіну становить 75 %.

Одержання вітаміну В12 за допомогою Pseudomonas fluorescens.т

Штам бактерій Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д - продуцент

вітаміну В12, який застосовується як антианемічний препарат у медицині та у виробництві кормових добавок для сільськогосподарських тварин та птиці. Росте при 28-32oС і рН 7-7,2 і постійному перемішуванні. Ріст

культури відбувається паралельно з біосинтезом вітаміну В12 в аеробних умовах. Продуктивність культури за 150 годин росту ферментації становить 130-150 мкг/мл.

При вирощуванні продуцента на середовищі з мелясою, неорганічними солями і стимуляторами вітаміноутворення концентрація

вітаміну В12 в культуральній рідині досягає величини 120-150 мкг / мл. Штам Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д характеризується

наступними ознаками: культурально-морфологічні ознаки: бактерії є грамнегативними рухомими паличками розміром 0,45-0,85×0,6×15 мкм, неспороутворюючі. На агаризованому середовищі утворюють округлі колонії 1-2 мм білого кольору. Клітини знаходяться в основному в скупченнях. Штам стійкий при пересівах на щільні середовища.

Ріст культури на рідких живильних середовищах відбувається

паралельно з біосинтезом вітаміну В12. Температурний оптимум росту 30oС, рН 7-7,2. На твердому живильному середовищі з мелясою утворюють біло-сірі блискучі колонії, до кінця 7 доби - з вираженим центром, розмір колоній 2-3 мм. Факультативний аероб.

185