Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij
РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ
19.Встановити верхню частину ДГГЕ-машини, що містить блок підключення до електроживлення та ін., на «ванну» з буфером і включити прилад (DCode ™, США) принаймні за 60 хвилин до початку електрофорезу, з тим щоб буфер встиг нагрітися до 60°С. Мішалку під «ванною» і перемішувальний насос поки не включати.
20.Після години полімеризації гелю обережно видалити «гребінку». Вийняти з штатива тримач з затверділим гелем між склом. Відмити гарячою водою залишки вазеліну з поверхонь. Промити «кишені» в гелі 0,5хТАЄ буфером за допомогою шприца.
21.Відключити ДГГЕ-машину, почекати 1 хв., зняти верхню частину приладу. Помістити «сандвіч» із стекол з гелем в утримувач, який знаходиться у «ванні» ДГГЕ-машини з гарячим буфером. Обидва утримувача в «ванні» приладу повинні бути заповнені «сандвічами» з гелем або без (холостий варіант). Встановити верхню частину приладу, що містить блок підключення до електроживлення, на «ванну» і під'єднати до блоку управління електроживлення.
22.Включити ДГГЕ-машину, включити верхню мішалку і мішалку, що знаходиться під «ванною» машини (300 об/хв.). Залишити в такому стані на період підготовки зразків.
23.Підготувати досліджувані зразки ДНК. Виключити прилад. Почекати 1 хв. Зняти верхню частину. Внести досліджувані зразки в «кишені» гелевих пластинок. Якщо зразків багато і їх вносять у всі «кишені» обох «сандвічів», то послідовність заповнення кишень другого гелю здійснюють в дзеркальному порядку щодо першого гелю. Не
використовувати «кишені» 1, 2 і 15, 16. Для внесення зразків ДНК в «кишені» використовують не традиційні,
аспеціальні наконечники з видовженими носиками. Повернути верхню частину приладу на місце.
24.Провести настроювання (при необхідності) програми блоку живлення (16 год., напруга 100 В) і самого ДГГЕ-приладу і включити його. Система надійно працює протягом заданого часу і автоматично відключиться після його закінчення.
Інтерпретація результатів ДГТЕ. Після електрофорезу продуктів ПЛР отримують фореграму ампліконів у вигляді горизонтальних смуг, по ширині відповідних ширині зубців використаної «гребінки», що мають «товщину», залежну від концентрації кожного амплікону (рис. 30).
Рис. 30. Гель-електрофорез плазмідної ДНК.
96
РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ
З урахуванням деяких особливостей і обмежень, перерахованих у вступі, результати ДГГЕ-аналізу можуть бути інтерпретовані таким чином. Формально кожна смуга (амплікон) належить відповідному виду. Відповідно, підрахунок кількості смуг в кожній доріжці є однією з характеристик мікроорганізмів аналізованого зразка. Має значення і відстань кожної смуги від початку фореграми. Ця відстань залежить від нуклеотидного складу амплікону. Відстань краще розраховувати у відносних одиницях, тобто щодо відповідних контролів, маркерів, які зазвичай розташовують по краях фореграми, а іноді ще й в середині. В якості маркерів використовують синтетичну суміш ампліфікованих 16S рДНК бактеріальних клонів з відомими відмінностями в денатуруючих
характеристиках. У реальних дослідженнях добре зарекомендували себе маркери, які є фрагментами 16S рДНК клонів бактерій: Eubacterium halii АО7, Fusobacterium pmusnitzii А10, Butyrivibrio fibrisolvens A11, Eubacterium plautii-like A27, Clostridium celerecrescens-Wkz A54, Ruminococcus obeumke A57, Eubacterium formicigenerans-like All і
Bifidobacterium XII. Істотне значення має і оптична щільність смуг. Останній показник відображає концентрацію ідентичних амплікон і фактично кількість ДНК (кількість клітин) відповідної бактерії в початковому зразку. Щільність смуг на ДГГЕ-фореграмі аналізують після сканування кожної фореграми і перенесення інформації в комп'ютер. Для аналізу щільності смуг використовують спеціальну програму Phoretix ID (NonLinear Dynamics Ltd., Newcastle upon Tyne, UK).
В даний час для аналізу складних фореграм, одержуваних в результаті аналізу природних зразків, використовують комплекс спеціальних комп'ютерних програм, суміщених зі статистичним аналізом результатів. Як приклад такого комплексного підходу можна рекомендувати кластерний аналіз, дискримінантний аналіз (SAS Institute, Inc., Сагу, USA), індекс Шенона та ін.
5.1.4. Виявлення і визначення мікроорганізмів FISH – методом
Для виявлення та визначення мікроорганізмів у природних зразках і після вирощування їх на середовищах розроблений метод гібридизації флуоресцентних олігомерних нуклеотидних послідовностей з нуклеїновими кислотами цілих клітин - fluorescent in situ hybridization (FISH).
Традиційно для виявлення присутності мікроорганізмів в тому чи іншому природному середовищі або в накопичувальній культурі потрібно було виділити ці мікроорганізми в чисту культуру і провести їх ідентифікацію. Пізніше були розроблені імунофлуоресцентні методи (ІФМ), що дозволяють виявити цікавлячий дослідника організм без виділення в чисту культуру. В основі будь-яких модифікацій ІФМ
97
РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ
використовується взаємодія антиген-антитіло, яке з'єднане з флуоресцентним фарбником. Специфічність реакції антиген-антитіло висока, тому й вірогідність виявлення мікроорганізмів в природних зразках або накопичувальних культурах теж висока. Недоліком є відносно довга процедура приготування сироваток з флуоресцентними барвниками, існування перехресних реакцій, а найголовніше - «віддаленість» реакції антиген-антитіло від генетичного коду досліджуваного організму. І хоча ІФМ використовуються широко, в даний час отримують перевагу методи, засновані на ідентифікації специфічних для конкретного організму нуклеотидних послідовностей ДНК (рРНК). До таких методів відносяться вже згаданий ДГГЕ, клонування і сіквенс специфічних послідовностей ДНК. Однак і ці методи теж мають свої недоліки, і головний з них - використання ПЛР, результати якої поки ще не можуть бути точно «конвертовані» у чисельність конкретного мікроорганізму. Недоліків ІФМ і деяких молекулярно-біологічних методів позбавлений метод, заснований на взаємодії забарвлених флуоресцентно олігонуклеотидних проб з відповідними ділянками 16S рРНК цілих клітин (FISH). Більш того, за допомогою цього методу можна враховувати навіть не культивуємі на середовищах мікроорганізми. З назви методу ясно, що цей метод заснований на використанні флуоресцентної мікроскопії, тому можливе його застосування для кількісного обліку клітин мікроорганізмів і методу проточної флуороцитометріі (ПФЦМ). Природно, як і будь-який інший метод, FISH має свої особливості. Наприклад, його чутливість залежить від типу використовуваного для досліджень зразка, застосованої молекулярної проби, виду барвника, ефективності фарбування (зв'язування) проби з барвником, умов проведення гібридизації та ін.
Для використання FISH-методу необхідно мати олігонуклеотидні проби, які можуть бути синтезовані, якщо дослідник знає послідовності нуклеотидів в 16S рРНК. Корисна інформація для створення відповідних проб може бути отримана в базі даних «Ribosomal Database Project». Нижче наводиться достатньо докладна методика виявлення та обліку бактерій в зразках, зокрема для виявлення Ruminococcus obeum-подібних бактерій за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Як зазначалося, умови гібридизації для різних мікроорганізмів повинні підбиратися індивідуально.
Досліджувані зразки повинні бути підготовлені, як і у випадку традиційного обліку мікроорганізмів з використанням флуоресцентного мікроскопа, тобто повинна бути проведена десорбція клітин, якщо, наприклад, зразок містить яку-небудь тверду фракцію, підібрано оптимальне розведення і т.д. На поверхню предметних стекол, попередньо покритих тонким шаром желатини, наноситься певний обсяг досліджуваного зразка. Скло зі зразком висушують 20 хв. при 45°С. Підсушені препарати піддають дегідратації, занурюючи препарат на 2-3 хв.
98
РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ
в ряд із збільшенням концентрацій (градієнту) розчинів етанолу від 50 до 75% і далі до 96%. Після цього на препарат наносять 10 мкл «гібрідізаційних» буферів (0,9 М NaCI; 20 мМ трис-НС1; рН 7,5; 0,1%-й додецилсульфату натрію, ДСН). Використовуваний обсяг гібридизаціонного буфера повинен містити (для даної конкретної методики і з урахуванням використовуваного обсягу), наприклад, 3 нг СУЗ-міченої Urobe63 проби на кожен мікролітр або 5 нг флуоресцеінізотіоціонату (ФІТЦ)-міченої Егес482 проби на кожен мікролітр. Потім препарат поміщають в термостат (відвертаючи його висихання ) і інкубують при 50°С протягом 3 год. у темряві. Після процесу гібридизації препарати промивають при струшуванні, поміщаючи на 10 - 20 хв. в 50 мл гібридизаційного буфера, але без SDS.
Для того щоб крім виявлення та обліку певного організму провести облік тотальної кількості клітин у досліджуваному природному зразку, в промивний буфер можна додати флуоресцентний барвник DAPI в концентрації 100 нг/мл. Після промиваючого буфера препарати слід промити у воді і негайно висушити на повітрі. Облік клітин за допомогою флуоресцентного мікроскопа проводять візуально або за допомогою цифрової камери і комп'ютера здійснюють імідж-аналіз отриманих знімків. Розрахунок кількості клітин виробляють, як і при традиційному обліку клітин, під мікроскопом. Приготовлені препарати деякий час можна зберігати при -20°С.
5.1.5. Застосування мікрочіпів в мікробіологічних дослідженнях
Високоефективне і швидке виявлення мікроорганізмів і їх ідентифікація в природних зразках - одне з основних завдань практичної мікробіології. Інший найважливіший напрям - виявлення мутацій в геномах організмів і тестування експресії генів. При вирішенні цих завдань все частіше застосовуються методи молекулярної біології. Найбільше значення такі методи набувають у випадках, коли потрібно в найкоротші терміни проаналізувати зразок на присутність хвороботворного агента, наприклад для обмеження поширення високо контагіозних захворювань, або якщо діагностика класичними культуральними методами трудомістка і займає дуже багато часу.
Імунно-флуоресцентний аналіз (ІФА) та FISH-метод дозволяють специфічно виявляти і враховувати клітини, що містяться в досліджуваному зразку. Однак обмеження обох підходів полягає в можливості виявлення мікроорганізмів тільки того виду, до яких були приготовлені імунні або ДНК-проби (зонди). Для виявлення клітин, що належать до різних таксономічних одиниць в одному і тому ж зразку, молекулярні зони (крім специфічності до різних мікроорганізмів) повинні нести різні мітки, в іншому випадку їх не можна буде розрізнити. Таким
99
РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ
чином, першим лімітуючим фактором широкого використання FISH є число доступних барвників, другим - проникнення молекулярної проби в клітину і процес зв'язування проби з комплементарною ділянкою нуклеїнової кислоти всередині клітини, третім, не менш важливим, - макроскопічні розміри використовуваного скла, а отже, великі затрати праці та дорогих реагентів та ін.
Одного з перших двох недоліків позбавлений метод точкової гібридизації (dot-blot), коли на спеціальній підкладці (наприклад, фільтрі) закріплюють молекулярну пробу (олігонуклеотидних послідовностей, часто радіоактивно мічену), що належить виду мікроорганізму, який вивчається дослідником. Після цього на фільтр наносять ізольований із зразка розчин тотальної нуклеїнової кислоти (НК). Після гібридизації і видалення незв'язаних НК визначають, чи була в дослідженій пробі НК, що належить мікроорганізму, чи ні. Однак цей метод, так само як і FISH, має недолік, пов'язаний з його макроскопічністю і, отже, високою трудомісткістю.
Багатьох недоліків методів dot-blot і FISH для аналізу зразків на наявність мікроорганізмів і вірусів вдалося уникнути при використанні технології біологічних мікрочіпів (слово «чіп» з англійської мови перекладається як «кристал» або «мікро-схема»). Метод біологічних мікрочіпів заснований, як і безліч інших методів, на здатності комплементарних одноланцюгових молекул нуклеїнових кислот до гібридизації. Гібридизація - це процес, в результаті якого дві комплементарні одноланцюгові нитки нуклеїнової кислоти утворюють стабільну дволанцюгову спіраль. Реакція гібридизації може відбуватися між двома комплементарними ланцюжками(молекулами) в розчині або між молекулами в розчині і комплементарними молекулами, іммобілізованими на твердій підкладці.
Застосування гібридизаційного аналізу на олігонуклеотидних мікрочіпах не тільки спрощує процедуру дослідження, але і надає принципово нові можливості для одночасної ідентифікації і вивчення цілого ряду генетичних локусів мікроорганізмів і вірусів. Технологія біологічних мікрочіпів дозволяє автоматизувати процес ідентифікації біологічних об'єктів.
Біологічний мікрочіп - це певна впорядкована множина мікроскопічних осередків, кожна з яких містить індивідуальний зонд і є, таким чином, самостійною реакційною одиницею. Відомо декілька принципово різних підходів до виготовлення мікрочіпів (DNA Microarrays, 1999). В Інституті молекулярної біології РАН традиційно розробляються так звані трьохмірні біочіпи, кожна клітинка яких являє собою мікроскопічну краплю поліакриламідного гелю (близько 200 мкм завтовшки), у якій рівномірно іммобілізовані ДНК-проби. Тривимірна пориста структура гелю дозволяє іммобілізувати проби в набагато більшій
100