Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

Контрольні питання:

1.Що таке антагонізм?

2.Назвіть мікроорганізми-продуценти антибіотиків.

3.Які методи застосовуються для визначення антагоністичної активності?

4.На які категорії поділяють взаємовідносини між мікроорганізмами?

5.Які групи взаємовідносин між мікроорганізмами відносять до сприятливих? Наведіть приклади.

6.Які групи співіснування мікроорганізмів виділяють у категорії “антагоністичні взаємовідносини”?

7.Де знайшло застосування явище мікробного антагонізму?

5.3.Індукція мутацій у клітинах штамів-продуцентів

Мутації, тобто успадковані зміни в генетичному матеріалі, є важливим біологічним явищем, оскільки обумовлюють, поряд з механізмами переносу генів, генетичну мінливість живих організмів. Вивчення мутантних штамів бактерій значно полегшує дослідження процесів, що протікають в клітині на молекулярному рівні. Сучасні методи картування мутацій дозволяють локалізувати гени або навіть групу генів, що відповідають за певний фенотип. Крім того, наявність достатнього набору мутацій полегшує визначення ферментативних стадій в біохімічних перетвореннях, дає можливість виявити і охарактеризувати нові біосинтетичні і регуляторні системи. Вивчення білків, змінених в результаті мутацій, дозволяє передбачати їх просторову структуру, визначати ділянки на білковій молекулі, відповідальні, наприклад, за зв’язування субстрату або ефекторної молекули (невелика молекула, зв'язується з репрессором або ферментом, що призводить до їх пригнічення або активації). Мутації є основою селекції мікроорганізмів з корисними властивостями, штамів-продуцентів антибіотиків, амінокислот або вітамінів.

У популяції мікроорганізмів мутанти можуть виникати спонтанно за рахунок нормальних клітинних процесів (рекомбінації, реплікації і репарації), а також у результаті впливу факторів зовнішнього середовища.

106

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

Однак частота виникнення мутантів в результаті спонтанних мутацій досить низька, наприклад у Е.coli частота такого процесу зазвичай не перевищує 10-9 на ген клітин за покоління. У тих випадках, коли певна мутація призводить до визначеного фенотипу, що дозволяє відбирати мутантні клітини і популяції, виявити такі рідкісні події не являється складним. На жаль, не завжди існує можливість для проведень подібного відбору. Рішенням цього завдання є збільшення мутантів в популяції мікроорганізмів за допомогою індукованих мутацій, що досягається обробкою клітин спеціальними хімічними, фізичними або біологічними агентами.

Прикладами хімічних мутагенів є нітрозогуанідін (НГ), етанметилсульфонат (ЕМС, викликає алкілування гуанідину), гідроксиламін (призводить до дезамінування цитозину), 5-бромурацил і 2- амінопурин, (аналоги основ, викликають помилки при реплікації ДНК), акридинові барвники (можуть вбудовуватись між сусідніми парами основ), фізичних - опромінення бактерій іонізуючим випромінюванням (викликає розриви основ) або ультрафіолетом (димеризує піримідинові основи) приводить відповідно до делецій і інверсій (поворот фрагмента ДНК на 180 °) або до делецій, транзицій і трансверсій (заміні в одному з кодонів пуринових основ на піримідинові або навпаки).

Мутагенний ефект хімічних сполук пов'язаний в основному з виникненням точкових мутацій. Велике значення мають умови обробки клітинної суспензії хімічним мутагеном, його концентрація, тривалість експозиції, рН середовища та ін.

При роботі з хімічними мутагенами, багато з яких володіють канцерогенною і токсичною дією, необхідно дотримуватися правил безпеки - треба працювати у витяжній шафі в гумових рукавичках і утилізувати розчини мутагенів як небезпечні відходи.

В якості біологічних мутагенів виступають транспозуючі фаги,

отримати. Різні види і навіть штами мікроорганізмів вимагають певних концентрацій мутагенів і умов для здійснення ефективного індукованого мутагенезу. Тому перед експериментом необхідно побудувати криві виживання клітин залежно від концентрації (дози) мутагенного фактора і часу експозиції.

Прояв мутацій необхідний, щоб відбулися реплікації і мутаційна зміна закріпилося в новосинтезованій молекулі ДНК. Фенотипово мутація проявляється через певний визначений час (сегрегаційний лаг-період), за який відбуваються процеси транскрипції і трансляції. Для появи нової ознаки має статися кілька поділів клітин в популяції (так званий

107

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

фенотиповий лаг-період), для цього суспензію клітин, оброблених мутагеном, культивують протягом певного періоду.

Щодо відбору мутантів, для вивчення екології мікроорганізмів застосовують декілька класичних методів. Широко використовується прямий відбір за фенотипом висівом на селективні середовища, метод з використанням індикаторних середовищ (з індикатором та хромогенним субстратом, наприклад) і метод непрямої селекції з відбитком колоній, що виросли на повноцінному агаризованому середовищі, на чашки з селективними середовищами. Для підвищення в популяції частки ауксотрофних мутантних штамів часто використовують пеніциліновий метод обробки мутантів, який елімінує значну кількість прототрофних клітин дикого типу, оброблених мутагеном культур на мінімальному середовищі з додаванням пеніциліну, що пригнічує синтез пептидоглікану клітинної стінки бактерій.

Розвиток методів генетичної інженерії дозволив використати її інструментарій для спрямованої зміни генетичного матеріалу в строго певних сайтах нуклеотидної послідовності і відповідно отримувати білки, які містять потрібні амінокислоти в заданих позиціях. Даний підхід отримав назву сайт-спрямованого мутагенезу. Наприклад,

досліджуваний ген вбудовують в двохланцюгову форму вектора на ос-not бактеріофага М13 і копіюють одноланцюгову форму фага з ДНК з використанням спеціального праймера, за допомогою якого в ген-мішень вносять точкову мутацію. Після трансформації клітин Е. coli дволанцюговими ДНК фага М13 ідентифікують фагові частинки, що несуть ген з потрібною мутацією, вбудовують мутантний ген в експресуючий вектор, синтезують білок, вимірюють його активність. Також можна вносити зміни в ген за допомогою плазмід. Можливість внесення заздалегідь запланованих змін до нуклеотидної послідовності дозволяє детально вивчати принципи функціонування клонованих ферментів, створюючи і досліджуючи їх мутантні форми. Сайтспрямований мутагенез також незамінний при вивченні складної системи регуляції експресії генів, він допомагає встановити роль тієї чи іншої ділянки хромосоми в цьому процесі.

Робота №21. Індукція мутацій у клітинах бактерій нітрозогуанідином

N-метил-N`-нітро-N-нітрозогуанід (НГ) є ефективним хімічним мутагеном, широко застосовуваним у генетиці бактерій, він з високою частотою індукує мутації при таких дозах, що не призводять до загибелі клітин. При обробці культури клітин НГ можна отримати до 20% ауксотрофних мутантів (тобто таких, що втратили здатність до синтезу необхідних для росту сполук). Розчини нітрозогуанідіна в 50-100 мМ

108

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

цитратному буфері (pH 5,5) необхідно готувати безпосередньо перед експериментом. Як правило, клітини з експоненційною фазою росту обробляють НГ в кінцевій концентрації 20-100 мкг / мл протягом 30 хв.

Мутаген викликає в основному заміни основ за рахунок їх змін у вилці реплікації, хоча є дані, що він також сприяє утворенню невеликих делецій. Дослідження розподілу мутацій, викликаних НГ, показали, що область мутації ДНК значно більш чутлива до дії цього мутагену, ніж інша хромосома. Ця особливість НГ часто призводить до утворення подвійних замін, що є істотним недоліком даного методу. Проте в кожному експерименті можна варіювати рівень виникнення таких мутацій. Дію НГ зазвичай зупиняють внесенням 50-100 мМ фосфатного буферного розчину з рН 7,0.

Матеріали, реактиви та розчини:

Стерильне середовище LB; цитратний буферний розчин наступного складу (на 0,5 л): 0,5 г лимонної кислоти; 4,4 г NaOH; довести до рН 5,5 за допомогою 2 М NaOH;

Фосфатний буферний розчин наступного складу (на 0,5 л): 8 г КН2Р04; 1,16 г NaOH; довести 2 М NaOH до рН 7,0; НГ (концентрація нітрозогуанідіна - 1 мг/мл у нітратних буферному розчині). Увага! НГ є небезпечною канцерогенною речовиною, працювати з ним необхідно у рукавичках; стерильний 0,4%-ий розчин NaCl.

Хід роботи:

А. Підбір оптимальних умов при дії НГ, побудова кривих виживання.

1.Засіяти одну колонію бактеріального штаму, що буде використана для мутагенезу, в мікробіологічну скляну пробірку з 5 середовища LB. Помістити пробірку на качалку і культивувати і 37°С і 240 об/хв. протягом ночі (12-14 год.).

2.Додати 4 мл нічної культури в колбу Ерленмейера з 4 мл рідкого середовища LB. Вирощувати культуру до середини логарифмічної фази росту при 37°С і 240 об / хв.

3.Осадити клітини центрифугуванням при 5000 g протягом 5 хв. при кімнатній температурі (стерильно!). Злити надосадкову рідину.

4.Промити клітини стерильним цитратним буферним розчином. Для цього ресуспендувати осад клітин в 40 мл цитрату буферного розчину. Центрифугувати при 5000 g протягом 5 хв. при кімнатній температурі. Злити супернатант.

5.Ресуспендувати клітини в 40 мл цитратного буферного розчину. Перенести по 5 мл суспензії у 8 стерильних мікробіологічних пробірок. Помістити їх у водяну баню при 37°С.

109

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

6.Внести в кожну з пробірок по 200 мкл розчину НГ. Виміряти час.

7.Через певний проміжок часу дістати одну пробірку з водяної бані. Осадити клітини на центрифузі при 12 000 g протягом 1-2 хв., промити одним об'ємом фосфатного буферного розчину і ресуспендувати в 5 мл фосфатного буферного розчину. Проби відбирати через 0, 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90 хв.

8.Висіяти розведення суспензії клітин з кожної пробірки на чашки

Петрі з агаризованим середовищем LB. Проби відібрати протягом перших 30 хв., висіяти по 100 мкл з розведень 10-3, 10-4 і 10-5. Решта проби висівається по 100 мкл щоденно з 10-1, 10-2, 10-3 і 10-4.

9.Помістити чашки в термостат і інкубувати при 37°С протягом

ночі.

10.Перерахувати число бактеріальних колоній, що виросли в чашках. Виходячи з використаного розведення, визначити кількість життєздатних клітин для кожного періоду часу при обробці НГ.

11.Побудувати криву виживання культури залежно від часу обробки НГ. Визначити часовий інтервал, при якому виживання складає

50%.

Б.Індукція мутацій під дією НГ

1.Засіяти одну колонію бактеріального штаму, що піддається мутагенезу, в мікробіологічну скляну пробірку з 5 мл LB. Помістити пробірку на качалку і культивувати при 240 об/хв. протягом ночі (12-14 год.).

2.Додати 1 мл нічної культури в мікробіологічну пробірку з 10 мл рідкого середовища LB. Помістити пробірку на качалку та інкубувати при 37°С і 240 об/хв. до досягнення культурою логарифмічної фази росту (~ 2 х

109 клітин/мл). Осадити клітини центрифугуванням при 5000 g при кімнатній температурі (стерильно!). Злити надосадову рідину.

3.Промити клітини цитратним буферним розчином. Для цього додати до осаду клітин 10 мл цитратного буферного розчину. Осадити клітини центрифугуванням при 5000 g при кімнатній температурі. Злити надосадову рідину.

4.Ресуспендувати клітини в 10 мл цитратного буферного розчину. Перенести по 5 мл клітинної суспензії у дві стерильні мікробіологічні пробірки. В одну пробірку додати 200 мкл розчину НГ, в другу НГ додавати не потрібно. Помістити пробірки у водяну баню (37°С) і інкубувати протягом певного часу, визначеного на попередньому етапі.

5.Перенести вміст кожної пробірки в стерильну склянку для центрифугування. Осадити клітини центрифугуванням протягом 5 хв. Злити супернатант.

110