Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

6.Відмити клітини від НГ. Для цього двічі промити їх рівною кількістю фосфатного буферного розчину, зібрати осад клітин центрифугуванням.

7.Ресуспендувати клітини з кожного варіанту в 10 мл рідкої LB і інкубувати протягом ночі при 37°С і 240 об/хв. Осадити клітини центрифугуванням при 5000 g. Промити клітини рівним об'ємом фізіологічного розчину. Ресуспендувати клітини в 500 мкл фізіологічного розчину, висіяти суспензії на чашки Петрі з селективним агаризованим середовищем.

8.Інкубувати чашки в термостаті при 37°С до появи колоній (через 12-

24год.) у варіанті з культурою клітин, оброблених НГ. Чашки з культурою, що не піддавалися дії мутагену, повинні бути чистими.

Додатки до методики

Нітрозогуанідін дуже небезпечний, оскільки є потужною канцерогенною речовиною. При роботі з розчином НГ обов'язково потрібно використовувати рукавички.

Підбір оптимальної дози НГ визначає ефективність мутагенезу. Високі дози НГ викликають утворення безлічі мутацій, різко знижуючи виживання клітин (ауксотрофності, летальні мутації). Навпаки, при недостатній обробці НГ складно відібрати бактерії з певним фенотипом за рахунок малого числа мутацій. Експериментально встановлено, що доза НГ, яка приводить до загибелі приблизно 50% клітин бактеріальних популяцій, в більшості випадків є оптимальною. Оскільки відомо, що різні штами в різному ступені чутливі до токсичної дії нітрозогуанідіна, то для визначення такої дози для кожного нового штаму доцільно мати криву виживання.

Для побудови кривих виживання клітин використовується одна й та ж доза НГ, але при різній тривалості впливу, або різні концентрації НГ протягом одного і того ж часового інтервалу. Якщо індукція мутагенезу пройшла недостатньо сильно, то треба провести обробку культури більш високими концентраціями мутагену (100 мкг/мл) або ж збільшити тривалість його впливу.

Для збільшення числа мутантів з бажаним фенотип клітини можна перенести в рідке середовище LB і культивувати протягом ночі. Потім вирослі культури висіваються на селективні чашки.

5.4.Способи відділення кінцевих продуктів

іоцінка концентрації клітин

Біотехнологічний процес отримання первинних та вторинних метаболітів можна схематично представити у вигляді наступних етапів:

111

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

1.Збереження інокуляту. Головною умовою для практичної ферментації є збереження інокуляту протягом тривалого періоду (бажано без його ділення, щоб запобігти спонтанних мутацій). Важливо не просто зберегти клітини життєздатними, але й зберегти їх здатність до утворення продукту.

2.Підготовка інокуляту: а) 1-2 шейкерні колби;

б) отримання спор на твердому середовищі (рис.32).

3.Попередня ферментація культури, яку проводять для отримання великої кількості інокуляту для промислового ферментеру.

4.Ферментація у промислових біореакторах (рис.33).

5.Відділення та очищення кінцевого продукту.

Метою будь-якого біотехнологічного процесу в промисловості є отримання певного продукту. Кінцевими продуктами біотехнологічних процесів може бути, наприклад, клітинна біомаса (виробництво кормових дріжджів), білок (виробництво дріжджового і бактеріального білка), продукти життєдіяльності мікроорганізмів (органічні кислоти, антибіотики, біогаз) і т. д.

Залежно від того, що є кінцевою метою біотехнологічного процесу, для відділення кінцевого продукту використовують різні методи. Для концентрування кінцевого продукту використовують різні фізичні та хімічні властивості частинок і молекул (вага, поверхневе натягнення, розчинність, заряд, температура кипіння, здатність до дифузії, розміри).

Так, для відділення клітин використовують осадження, фільтрацію (у тому числі мембранну), центрифугування, флотацію. Такі методи використовують, наприклад, при поділі водно-мулової суміші, очистки стічних вод (аеробної та анаеробної), отриманні клітинної біомаси (дріжджі) і т. п.

Крім самих клітин кінцевими продуктами можуть бути внутрішньоклітинні метаболіти або виділилися в зовнішнє середовище позаклітинні метаболіти. У будь-якому випадку першим етапом має бути відділення клітин від середовища.

Далі може слідувати руйнування відокремлених клітин (якщо потрібно відділення внутрішньоклітинних продуктів). Клітини можуть бути зруйновані такими методами:

–фізичними (ультразвуком, заморожуванням - відтаюванням, пресуванням, розмеленням у кульових млинах);

–хімічними (ліофілізацією, екстракцією, обробкою детергентами, кислотами);

–біологічними (ферментами, фагами, інгібіторами).

Після руйнування клітин або при виділенні продукту з культуральної середовища для максимального вилучення продуктів використовуються методи:

112

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

Рис. 32. Схема біотехнологічного процесу

(за Тейлор та ін., 2005).

113

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

Рис.33. Принципова схема біореактору:

1 – мотор; 2 – подача живильного середовища; 3 – деаератор (прилад для очищення від присутніх небажаних газових домішок); 4 – система контролю параметрів живильного середовища; 5 – охолоджуюча або обігріваюча рубашка; 6 – мішалка; 7 – аератор; 8 – отвір для виведення біомаси; 9,10 – подача та вихід холодної або теплої води відповідно.

–екстрагування (використовуючи властивості гідрофільності і гідрофобності);

–хроматографії (адсорбційна, іонообмінна, гель-хроматографія - речовини поділяються за молекулярною вагою);

–мембранних процесів (ультрафільтрація, зворотний осмос, діаліз);

–кристалізації і осадження;

–висушування (конвективне - в потоці повітря, контактна - з адсорбентом, сушка після заморожування - ліофілізація).

Фільтрація. Для отримання бактеріальних клітин з культуральної середовища часто використовують два типи фільтрації: осадова і мембранна. Часто для поліпшення відділення клітинної маси від рідини використовують додавання речовин, що збільшують розміри бактеріальних агрегатів - флокулянтів (наприклад, поліакриламід).

Для осадової фільтрації використовують високопористі матеріали з глибокими і звивистими порами. Фільтрувальна система складається з підкладки фільтра (фільтрувальна папір або тканину, великопористі) і товстого шару фільтруючого матеріалу (целюлози, діатомової землі тощо). При фільтруванні бактерії, по мірі їх накопичення, зіскоблюють з поверхні фільтра. Такий спосіб дозволяє добре очистити фільтрат, але для стерилізації середовищ непридатний, а біомаса часто виявляється забруднена фільтратом.

114

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

Мембранна фільтрація заснована на затримці бактерій на поверхні фільтра з порами, діаметр яких змінюється у вузьких межах. Вибір мембрани залежить від характеристик культури і бажаного продукту – клітини або фільтрату.

Так, при стерилізації фільтруванням, потрібна мембрана з діаметром пор менше 0,5 мкм (розміри клітин 1,5-0,5 мкм).

Центрифугування. Цей спосіб дає менш повне розділення, ніж фільтрація. Але такий спосіб дає можливість отримати середовище і клітини, незабруднені фільтратом. Швидкість осадження в процесі центрифугування залежить від таких факторів, як в'язкість середовища, розмір часток і різниця в щільності між частинками і середовищем. Всі типи центрифугування працюють за принципом регульованого додавання до відцентрової сили у роторі, що обертається.

Оцінка концентрації клітинної біомаси. Відділення клітин від середовища є також складовою частиною при оцінці концентрації клітин в середовищі. Для підрахунку кількості мікроорганізмів у досліджуваному зразку існує велика кількість методів. Найбільш поширеними методами кількісного обліку мікроорганізмів є наступні.

1.Методи прямого підрахунку мікроорганізмів (у певному обсязі проби або в наважці). Методи зводяться до підрахунку кількості клітин мікроорганізмів у певному обсязі мікробної суспензії безпосередньо під мікроскопом, перераховуючи далі чисельність мікроорганізмів на одиницю ваги або об'єму (вага - для твердих тіл, об'єм - для рідин і газів). Підрахунок клітин ведуть на фіксованих забарвлених мазках (грунт, мули, рослини і рослинні залишки), з використанням мембранних фільтрів, використовуючи світлову або електронну мікроскопію.

2.Кількість мікроорганізмів можна розрахувати за кількістю органічного азоту або вуглецю. Використовується в біотехнології, при культивуванні чистих культур мікроорганізмів.

3.Кількість бактерій можна розрахувати за оптичною щільністю мікробної суспензії. Використовується в біотехнології, при культивуванні мікроорганізмів, в медицині.

4.Метод висіву на щільні поживні середовища (в чашки Петрі). Цим методом визначається не загальна кількість мікроорганізмів у досліджуваному зразку, а чисельність різноманітних фізіологічних груп мікроорганізмів або організмів. Залежно від використаного живильного середовища це можуть бути сапрофіти, сульфатредуктори, амоніфікатори, нітріфікатори, денітріфікатори, залізобактерії і т. д. Метод зводитися до приготування розведень проб і посіву розділених зразків на поживні середовища різного складу з подальшою інкубацією посівів і підрахунком колоній, що виросли. Умовно приймається, що з однієї клітини виростає одна колонія.

115