Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

здійснюється при 94°С протягом 1 хв. Початковий відпал праймерів відбувається при температурі 60°С протягом 1 хв. і потім температура знижується на 1°С в кожному другому циклі до 55°С (у перших 11 циклах). У наступних 19 циклах відпал проводять при 55°С і також протягом 1 хв. Час «розтягування» (extension) праймерів дорівнює 2 хв. при 72°С. Заключна стадія «розтягування» здійснюється при 72°С протягом 10 хв. і потім суміш охолоджують до +4°С.

Якість продуктів ПЛР (амплікон), розмір яких при описаних вище умовах буде дорівнює 474 парам нуклеотидів (п.н.), перевіряють електрофоретично в стандартному (1%-м) агарозному гелі з подальшим фарбуванням етідіум бромідом. Продукти ПЛР можна зберігати деякий час при -20°С.

5.1.3. Денатуруючий градієнтний гель-електрофорез (ДГГЕ)

Цим методом проводять поділ фрагментів ДНК однакової довжини, але різних за складом комплементарних пар нуклеотидів (п.н.). Теоретично метод дозволяє розділити амплікон величиною до 500 п. н., що відрізняється всього лише однією парою нуклеотидів (Myers et al., 1998). Отже, цей метод особливо корисний як при порівнянні, наприклад, мікробних спільнот будь-яких зразків, так і при порівнянні вихідних варіантів і мутантів чистих культур. В останньому випадку ПЛР повинна бути проведена із використанням специфічного для даної мутації праймера (функціональним праймером). Разом з тим аналіз ДГГЕ методом ПЛР ампліфікованих екстрактів ДНК з універсальними праймерами, екстрактів, виділених з природних зразків з високою чисельністю та різноманітністю мікроорганізмів (багаті грунти, компости та ін.), дозволяє виявити не всю різноманітність, а чисельно домінуючі види.

Поділ в ДГГЕ грунтується на зниженні електрофоретичної рухливості частково розплавленої дволанцюжкової молекули ДНК (амплікона) в поліакриламідному гелі, що містить лінійно збільшуваний градієнт денатурантів ДНК, якими є суміш сечовини і формамід. Плавлення фрагментів ДНК забезпечується в дискретних місцях - доменах плавлення, смугах пар основ з ідентичною температурою плавлення. Коли домен, схильний до плавлення, досягає «свого» місця в денатурую чому градієнті гелю, спіральна структура ДНК переходить в частково розплавлений (розщеплений) стан, і рух молекули практично зупиняється. Описаний підхід дозволяє розділити до 50% всіх варіантів досліджуваних послідовностей в фрагментах ДНК довжиною до 500 п.н. Відсоток розділення (чутливість) може бути збільшений практично до 100%, якщо прикріпити до поділених шляхом ДГГЕ ДНК-фрагментів «фіксатори» - нуклеотидні послідовності з високим вмістом ГЦ-основ, які потім будуть діяти як високотемпературні домени плавлення. Прикріплення таких

91

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

послідовностей здійснюється або в процесі клонування, або при проведенні ПЛР, коли до синтезованих ампліконів прикріплюються додаткові нуклеотидні послідовності розміром від 40 до 50 п.н., які в свою чергу були прикріплені до 5'-кінця праймера при його синтезі.

Таким чином, в методі ДГГЕ задіяні наступні фактори: 1) однаковий розмір (довжина) фрагментів ДНК (однакова кількість пар нуклеотидів), наприклад 474 пари, з відповідними «фіксаторами» на кінцях, отриманими в процесі ПЛР; 2) склад нуклеотидів амплікону; 3) підвищена, але стабільна температура, яка ініціює плавлення фрагментів ДНК, але через різний склад нуклеотидів плавлення цих фрагментів ДНК відбувається сильніше чи слабше; 4) електричне поле забезпечує рух заряджених фрагментів ДНК в гелі з певною швидкістю; 5) наявність в гелі хімічних денатурантів, причому ці денатуранти повинні утворювати в гелі градієнт - від дуже низької концентрації в верхній частині гелю до максимально високої в нижній частині. Найбільш широко використовуваний варіант ДГГЕ - це «паралельний» денатуруючий градієнт, паралельний внаслідок того, що денатуруючий градієнт збільшується в тому ж напрямку, що й напрямок електричного поля.

Робота № 19. Аналіз ДГГЕ методом ПЛР ампліфікованих екстрактів ДНК мікроорганізмів

екстрактів ДНК мікроорганізмів (за Van Diepeningen et al., 2003), можна буде приготувати денатуруючий градієнт в межах від 45 до 60%, де 100%-й денатуруючий ефект створюють 7 М сечовиною і 40%-й формамідом, а 8%-й акриламід без сечовини і формамід забезпечує нульовий денатуруючий ефект.

Матеріали. Кількість посуду і реактивів визначається кількістю досліджуваних зразків: рукавички гумові для роботи в лабораторії; пробірки типу Еппен-Дорф об'ємом від 0,2 до 1,0 мл; автоматичні піпетки з наконечниками і робочими об'ємами від 1 мкл до 5 мл; 4 скляні пластинки, дві розміром 22,3х20 см і дві – 20х20 см; пластикові термостійкі смужки, що визначають товщину гелю (Spacers), товщиною 1 мм; целофанова плівка розміром не менше великих скляних пластин (Amersham Pharmacia Biotech AG, Uppsala, Sweden); «гребінки»; пластмасові прозорі (пружні)

пластинки (Gelbond ®), (Amersham Pharmacia Biotech, AG, Uppsala, Sweden, 80-1129-37); шприци різного об'єму з голками.

Устаткування: Магнітні мішалки різних розмірів і потужності; качалка нахилена, що обертається із змінною швидкістю обертання; рНметр; холодильник; морозильна камера на -20°С; ДГГЕ-машина [The Dcode system, BIORad Laboratories, США] для проведення електрофорезу; блок живлення для ДГГЕ-машини; спеціальний двохкамерний стакан для приготування і створення градієнта; шланги різного діаметру, зокрема 1,7

92

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

мм (внутрішній діаметр); перистальтичний насос з точно програмованою швидкістю подачі рідини (Heidolph PD 5201, The Netherlands).

Реактиви і їх підготовка для приготування гелю з денатуруючим градієнтом: Іонообмінна смола AG 501-Х8 (Bio-Rad, США) і деіонізований формамід (Sigma, США). Останній готують додаванням 12,5 г іонообмінної смоли до 250 мл (100% - го) формамід. Перемішують суміш при кімнатній температурі протягом години. Пропускають розчин через фільтрувальний папір, уникаючи попадання смоли. Зберігають у темряві при температурі 4-6°С. Розчин КОН в метанолі (5%-й) для очищення стекол, використовуваних для приготування гелю. Сечовина-формамід (СФ), 45%-й розчин в 6%-м розчині акриламіду-бісакріламіду. Готують змішуванням 47,3 г сечовини (Bio-Rad, США); 37,5 мл 40%-го акриламідубісакріламіда (37,5:1, Bio-Rad, США); 45 мл деіонізований формамід; 2,5 мл 50хТАЄ (тріс-Е ЦА) буфера (Bio-Rad, США); 250 стерильної деіонізованої води (ДІВ). Розчин можна зберігати в темному скляному посуді до 6 міс. при 4°С. Сечовина-формамід, 60%-й розчин в 6%-м розчині акриламіду-бісакріламіду. Готують додаванням 63,0 г сечовини, 37,5 мл 40%-го акріламіда-бісакріламіда (37,5: 1), 60 мл деіонізований формамід, 2,5 мл 50 х ТАЄ буфера, 250 стерильної ДІВ. Розчин можна зберігати в темному скляному посуді до 6 міс при 4°С. Персульфат амонію (АПС, Bio-Rad, США) готують у вигляді 10%-го розчину (вага/ об'єм) у стерильній ДІВ. Розливають по 400 мкл в 1,0 - 0,5 мл пробірки (Еппендорф) і зберігають при -20°С, кожен раз використовуючи нову пробірку.

Реактиви і їх підготовка для фарбування нуклеїнових кислот в гелі азотнокислим сріблом після форезу: Набір (kit) включає реагенти:

азотнокисле срібло (Bio-Rad, США), окислювач та проявник. Наведеної нижче кількості достатньо для обробки двох пластин гелю. Зберігати набір потрібно в холодильнику. Розчин для фіксування гелю готують змішуванням (обсяг/ обсяг) 10%-го етанолу і 5%-ї оцтової кислоти. Для фіксування одного гелю потрібно 400 мл. Для приготування розчину використовують ДІВ. Окислювач готують розчиненням 15 мл (10-кратно концентрованого) реагенту зі згаданого вище набору (Bio-Rad, США) в 150 мл деіонізованої води. Кожного разу необхідно готувати свіжий pacmeopl срібний барвник (на основі азотнокислого срібла) готують розчиненням 15 мл (10-кратно концентрованого) реагенту зі згаданого вище набору (BioRad, США) в 150 мл ДІВ. Кожний раз готується свіжий pacmeopl проявник готують розчиненням 16 г проявника, взятого з набору (Bio-Rad, США), в 500 мл ДІВ. Зберігають при 4°С, зупиняється реакція прояву розчину, що складається з 5%-го розчину оцтової кислоти в ДІВ. Консервуючий розчин для гелю складається з суміші 25% етанолу (обсяг/обсяг) і 10% (обсяг/обсяг) гліцеролу. Розчин може бути використаний багаторазово.

93

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

Завантажувальний буфер (ЗБ) складається з 1,5 мл гліцерину і 12,5 мг бромфенол блакитного (БФГ) в 5 мл ДІВ.

Хід роботи:

1.Ретельно вимити великі скляні пластинки з миючим засобом і м'якою (не дряпає скло) губкою. Промити водопровідною і ДІВ. Висушити скельця. Промити чистим (96%) етанолом, протерти чистою бавовняною серветкою. Скляні пластинки меншого розміру починають мити спочатку сумішшю КОН/метанол, а далі так само, як і великі.

2.Вирізати пластинки (Gelbond ®) за розміром великих скелець, не видаляючи папір, що їх покриває. Близько 0,5 мл налити на одну з поверхонь великого скла і накрити скло вирізаною платівкою гідрофобною стороною до скла. Виявлення гідрофобного боку пластинки здійснюється нанесенням на неї краплі води: на гідрофобній стороні вода не розтікається.

3.Ретельно розгладити пластинку на поверхні скла (не допускати утворення повітряних бульбашок) і після цього видалити папір. Висушити пластинку за допомогою етанолу і чистої бавовняної серветки. Обдути поверхню підсушеної пластинки струменем чистого повітря. Обдути поверхню другого (меншого) скла.

4.Відмити 96%-м етанолом пластикові термостійкі смужки, що визначають товщину гелю (Spacers). Нанести пальцем (в рукавичці) вазелін на край скла покритого платівкою Gelbond ®. Ширина вазелінової смужки ~ 1 см. Покласти на вазеліновий шар спейсера, покрити їх зверху вазеліном і покласти меншою стороною, промитою в КОН в етанолі, всередину.

5.Помістити «сандвіч» із скла в спеціальний утримувач, компонент ДГГЕ-приладу. Закрутити рівномірно затискачі тримачів. Всі краї повинні бути ідеально рівними і платівка ніде не повинна виступати. Замазати вазеліном отвір між стеклами і нижньою частиною «сандвіча». Промазати акуратно вазеліном бічні сторони «сандвіча» (там, де вставлені спейсери).

6.Промазати вазеліном нижню пластикову смужку, що лежить в спеціальному штативі, на яку встановлюють «сандвіч» із скла, і встановити скло, затиснувши його в тримачі, в цей штатив. Дещо послабити затискачі утримувача і за допомогою спеціальної пластинки (вона додається до приладу), вставляючи її між стеклами, перевірити простір. При цьому не можна торкатися вазеліну, який може виступати збоку, а особливо на дні «сандвіча» із скла. Затиснути затискувач. Якщо «сандвіч» із стекол виявиться не герметичним, то, при заливанні в нього гелю, останній буде просто витікати.

7.Штатив з «сандвічем» із скла повинен бути встановлений на суворо горизонтальній поверхні. При необхідності приготувати два таких «сандвіча» із скла.

94

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

Приготування пластинок гелю з денатуруючим градієнтом.

8.Розморозити одну пробірку з АПС.

9.Вставити в шланг для подачі гелю з двокамерного стакана нову голку. Відкрити отвір, що з'єднує камери склянки, відкрутивши затискувач. Промити обидві камери ДІВ, відкачуючи ДІВ за допомогою перистальтичного насоса при швидкості 110 мл/хв. Висушити систему, продуваючи стиснутим повітрям. Закрити отвір, що з'єднує камери склянки.

10.Приготувати розчини, які містять 45%-й розчин сечовиниформаміду (низька концентрація, НК), 60%-й розчин сечовина-формамід (висока концентрація, ВК) і «закріплювач» гелю в 50 мл пластикових пробірках (підписаних!).

11.Додати АПС і ТЕМЕД (тетраетил метилен діамін)до низької і до високої концентрацій сумішей сечовина-формамід (СФ) і негайно приступити до виконання операцій (5-8).

12.Перелити розчин СФ високої концентрації в праву частину двокамерного стакана, низької концентрації - в ліву. Включити магнітну мішалку. Голку, з'єднану зі шлангом, що відходить від двокамерного стакана і проходить через перистальтичний насос, опустити між стеклами «сандвіча».

13.Відкрити отвір, що з'єднує камери стакана, відкрутивши затискувач, і негайно включити перистальтичний насос зі швидкістю 4,0 мл/хв. Уважно контролювати процес заповнення простору між склом та сумішшю розчинів. Перевірити, чи немає витоку розчинів!

14.Перекачування гелю займає 10 хв. Як тільки розчини будуть повністю перекачані між склом, відразу ж ретельно промити двокамерний стакан і трубку ДІВ, перекачуючи воду тим же насосом, але зі швидкістю 10 мл/хв., і висушити стисненим повітрям. Після цього голку замінити новою.

15.Ретельно вимиту, в тому числі 96%-метанолом, і потім висушену «гребінку», що створює 16 кишень (в які вноситимуться продукти ПЛР), вставити в простір між стеклами, які до цього часу мають бути майже повністю заповнені гелем.

16.Внести 10%-й АПС і ТЕМЕД в закріплювач. Швидко набрати цей розчин у шприц об'ємом 10 мл, насадивши при цьому нову голку, і нанести його на поверхню ще не застиглого гелю між склом під «гребінку», так щоб гель ледь виступав над низьким склом. Не допускати

утворення повітряних бульбашок як на попередньому, так і на даному етапі. Ретельно промити шприц дистильованою водою.

17. Залишити гель на 1 год. для полімеризації.

Електрофорез ДНК в денатуруючому градієнті гелю.

18. Залити свіжоприготовлений 0,5 х ТАЄ буфер в «ванну» ДГГЕмашини до позначки «Fill» (7 л).

95