Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

розрізняються в більшому ступені, то специфічна реассоціація ДНК-ДНК стає такою слабкою, що не піддається вимірюванню. У такому випадку гібридизація ДНК-рРНК дозволяє значно збільшити коло організмів, у яких можна визначити ступінь генетичної гомології завдяки тому, що на відповідно невеликій ділянці бактеріального генома, що кодують рибосомальні РНК, вихідна послідовність основи зберігається значно повніше, ніж на інших ділянках хромосоми. У підсумку методом ДНК- рРНК-гібридизації часто знаходять досить високу гомологію геномів бактерій, у яких реасоціація ДНК-ДНК не виявляє помітної гомології.

Для ідентифікації бактерій іноді використовують також метод ДНКзондів (генних зондів) - різновид методу молекулярної гібридизації ДНКДНК. Реакція гібридизації ведеться в цьому випадку не між двома препаратами тотальної ДНК, а між фрагментом нуклеотидної послідовності ДНК (зондом), що включає ген (генетичний маркер), відповідальний за якусь певну функцію (наприклад, стійкість до антибіотика), і ДНК досліджуваної бактерії. Найпоширенішим способом створення генних зондів є виділення специфічних фрагментів шляхом молекулярного клонування. Для цього спочатку створюють банк генів досліджуваної бактерії розщепленням її ДНК ендонуклеазами рестрікції, а потім відбирають потрібний клон із суми фрагментів ДНК методом електрофорезу з наступною перевіркою генетичних властивостей цих фрагментів методом трансформації.

Далі обраний фрагмент ДНК лігують до складу відповідної плазміди (вектора), а цю комбіновану плазміду вводять в зручний для роботи штам бактерій (наприклад, Escherichia coli). З біомаси бактерії, що несе ДНКзонд, виокремлюють плазмідну ДНК і мітять її, наприклад, радіоізотопної міткою. Потім здійснюють гібридизацію ДНК-зонда з ДНК бактерії. Гібридні ділянки, що утворились проявляють методом авторадіографіі. За відносної частоти гібридизації генетичного маркера з хромосомою тієї чи іншої бактерії роблять висновок про генетичну спорідненість цих бактерій з досліджуваним штамом.

Для ідентифікації бактерій і створення філогенетичної системи їх класифікації найбільш широке поширення і значення набув метод аналізу нуклеотидних послідовностей в рибосомальних РНК. Молекули 5S, 16S і 23S рРНК містять ділянки з найвищим ступенем генетичної стабільності. Вважають, що вони перебувають поза механізму дії природного відбору і еволюціонують лише в результаті спонтанних мутацій, що відбуваються з постійною швидкістю. Накопичення мутацій залежить тільки від часу, тому інформація про нуклеотидні послідовності цих молекул вважається найбільш об'єктивною для визначення філогенетичної спорідненості організмів на рівні від підвиду до царства. У разі аналізу 5S рРНК зазвичай визначають повну послідовність нуклеотидів, яка в цій молекулі у прокаріотів складає 120 нуклеотидів. При дослідженні 16S і 23S рРНК, що

81

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

містять 1500 і 2500 нуклеотидів відповідно, часто проводять аналіз олігонуклеотидів, отриманих з цих молекул за допомогою специфічних ендонуклеаз рестрикції. Найбільш широке поширення набуло вивчення послідовності нуклеотидів в 16S рРНК. Вивчення структури 16S рРНК представників різних мікроорганізмів привело до виявлення серед прокаріотів групи архей. Значення коефіцієнта подібності SAB, що відокремлюють 16S рРНК бактерій і архей, лежать в межах 0,1, в той час як значення <SAB, рівне 1,0, відповідає повній гомології нуклеотидних послідовностей, а 0,02 - рівню випадкового збігу.

Все частіше для ідентифікації бактерій пропонують дендрограми, що показують взаємини між бактеріальними родами, видами або штамами на основі вивчення послідовності нуклеотидів (або олігонуклеотидів) в рРНК, а також ДНК-ДНК і ДНК-рРНК гібридизації. Однак ідентифікація бактерій до родів на підставі тільки генетичних методів без попереднього вивчення їх фенотипових характеристик часто взагалі неможлива. Тому кращим підходом у роботі з систематики бактерій вважається вивчення як генотипових, так і фенотипових властивостей. У разі невідповідності між філогенетичними і фенотиповими даними пріоритет тимчасово віддають останнім.

Особливою проблемою є ідентифікація таких бактерій і архей, особливо морських видів, які не спроможні рости на відомих лабораторних живильних середовищах і для яких тому не можна було отримати чисту культуру. До недавнього часу ця проблема здавалася нерозв'язаною. Однак приблизно 15 років тому були розроблені методи, що дозволили екстрагувати, клонувати, секвенувати і порівнювати рибосомальні РНК прямо з навколишнього середовища. Це дозволило точно порахувати і ідентифікувати мікроорганізми, що населяють даний біотоп без їх виділення в чисту культуру. Ідентифіковані таким чином «некультивовані» в лабораторії мікроорганізми можуть бути навіть описані, але з приєднанням слова «candidatus» (кандидат). Слово «candidatus» буде супроводжувати новий вид до тих пір, поки ученими не будуть знайдені умови культивування цього організму в лабораторій і не буде отримана його чиста культура, що дозволить вивчити всі його властивості та опублікувати в якості узаконеного.

Ідентифікацію бактерій проводять зазвичай за допомогою

«Визначника бактерій Берджі» (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology). Перше видання цього посібника було здійснено в 1923 р. під керівництвом відомого американського бактеріолога Д. Берджі (DHBergey, I860-1937). З тих пір воно регулярно перевидається за участю провідних вчених-мікробіологів світу. В 9-му виданні визначника (1994) усі бактерії розділені на 35 груп за фенотиповими ознаки, що легко визначаються. Ці ознаки винесені в назви груп. Таксономічне положення бактерій всередині груп визначається за допомогою таблиць і ключів, складених на основі

82

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

невеликого числа фенотипових ознак. Диференціювальні таблиці для диференціації видів бактерій деяких родів, наприклад роду Bacillus, не наводяться, а читач відсилається до "Посібника Берджі з систематики бактерій».

У 5-томному «Керівництві Берджі з систематики бактерій» (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001-2011) міститься більш повна інформація про таксономічне положення бактерій. Для кожної групи бактерій дається опис притаманних їм родів і видів, у тому числі з неясним таксономічним статусом. Крім докладного фенотипового опису, що включає морфологію, організацію і хімічний склад клітин, антигенні властивості, вид колоній, особливості життєвого циклу та екології, в характеристиці родів наводяться також відомості про зміст ГЦ в ДНК, результатах гібридизації ДНК-ДНК і ДНК-рРНК. Ключі та таблиці дозволяють ідентифікувати бактерії не тільки до роду, але і до виду. Крім цього є ряд статей і книг, в яких пропонуються оригінальні ключі для ідентифікації окремих груп бактерій, наприклад бацил, псевдомонад, актиноміцетів, ентеробактерій.

Мета роботи. Освоїти роботу з визначником бактерій Берджі.

Матеріали та обладнання. Визначник бактерій Берджі, данні визначення ферментативних властивостей зашифрованих викладачем культур бактерій, предметні скельця з готовими препаратами зашифрованих культур бактерій, мікроскоп, імерсійне масло.

Хід виконання роботи:

1. Уважно промікроскопіюйте з імерсійною системою готовий препарат невідомої Вам культури бактерій, охарактеризуйте морфологію клітин

3.За визначником бактерій Берджі визначте родини, рід і вид даних мікроорганізмів.

4.Детально запишіть характеристику ідентифікованої культури бактерій в табл.14.

5.1.Ідентифікація мікроорганізмів - продуцентів із природних ценозів без виділення в чисті культури

Востанні десятиліття XX в. було розроблено досить багато методів для характеристики мікробної різноманітності в природних середовищах

83

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

Таблиця 13 Ідентифікація мікроорганізмів за визначником бактерій Берджі

існування і в першу чергу грунту як найбільш складної системи методів, заснованих на екстрагуванні і дослідженні ДНК тотального мікробного ценозу(Muyzer and Smalla, 1998).

До таких методів відносяться: аналіз реасоціаціі ДНК; гібридизація ДНК мікробного ценозу; визначення профілів процентного складу ГЦоснов ДНК; порівняльний аналіз сіквенс фрагментів рестрикції ДНК; аналіз поліморфізму фрагментів рестрикції 16S рДНК; рестрикційний аналіз ампліфікованих рибосомальних ДНК 16S рДНК генів; клонування ДНК-фрагментів, отриманих зворотною транскрипцією 16S рРНК і клонування ампліфікованих за допомогою ПЛР рДНК фрагментів,

84

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

денатуруючий градієнтний гель електрофорез (ДГГЕ в англійській транскрипції - DGGE) 16S РДНК амплікон (Muyzer et aL, 1998) та деякі інші. У результаті з'явилася реальна можливість здійснювати виявлення та ідентифікацію відомих бактерій в природних зразках без виділення цих бактерій в чисті культури, а також виявляти присутність в зразку, що досліджується, неідентифікованих(відсутніх у банку даних, колекціях), нових організмів.

При виконанні таких досліджень необхідне проведення ряду послідовних операцій:

1.Перша операція – це руйнування клітин, виділення нуклеїнових кислот (НК) і при необхідності їх додаткове очищення за допомогою відповідних наборів реактивів.

2.Наступна найважливіша операція – ампліфікація досліджуваних ділянок у виділеній суміші НК для збільшення і вирівнювання концентрації цих ділянок (із застосуванням відповідних праймерів - затравок) в результаті полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

3.Після цього проводиться перевірка наявності та чистоти продуктів ПЛР електрофоретично в агарозному гелі.

4.Отримані ПЛР-продукти – концентрована FISH суміш ампліфікованих ділянок НК (амплікон), що належать різним бактеріям, розділяють, наприклад, методом ДГГЕ. Якщо на цій стадії ввести відповідні контролі, то можна провести і попередню ідентифікацію досліджуваних мікроорганізмів. Однак для достовірної ідентифікації, як і для виявлення нових організмів, потрібно буде провести вилучення (вирізання) окремих смуг (амплікон) з електрофореграми гелю і визначення їх нуклеотидних послідовностей (секвенування).

5.Виявлені послідовності порівнюють з даними, наявними в міжнародному банку генів, після чого складають списки виявлених мікроорганізмів і будують філогенетичні схеми мікробного ценозу.

Вякості додаткової, але обов’язкової інформації при описі нових мікроорганізмів використовують дані про процентний склад ГЦ-основ ДНК кожної чистої культури і ступінь ДНК-ДНК гомології знову описуваних штамів і відомих або близькоспоріднених з колекцій культур. Однак обидві операції правомірні тільки лише при роботі з чистими культурами.

Кожна з перерахованих вище операцій досить складна і відповідальна і вимагає певних навичок, точної відповідності прописам відповідних методик, а саме головне - використання стандартних реактивів та спеціального обладнання. Залежно від поставленого завдання деякі операції можуть бути виключені, а інші, навпаки, розширені або проведені багаторазово. В результаті таких досліджень можна ідентифікувати окрему чисту культуру, а також отримати перелік мікроорганізмів, вирощених, наприклад, у вигляді окремих колонії на агаризованому середовищі або,

85