Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

Мікроорганізми, які використовуються у промисловій біотехнології, належать до різних фізіологічних і таксономічних груп та істотно відрізняються одні від одних за морфолого-культуральними та фізіологобіохімічними ознаками. З більш як 100 000 відомих видів мікроорганізмів у промисловості використовують відносно мало — близько 100 видів, до яких належать кілька тисяч штамів.

Промислові штами повинні відповідати таким вимогам: рости на дешевих і доступних субстратах; характеризуватися високою швидкістю росту і синтезу цільового продукту; синтезувати максимум цільового продукту за мінімального утворення побічних; бути генетично й фізіологічно стабільними, стійкими до фагів і сторонньої мікрофлори, нешкідливими (непатогенними) для людей і навколишнього середовища; бажано, щоб продуценти були термофільними, ацидофільними (або алкалофільними), оскільки у цьому разі знижується можливість контамінації сторонньою мікрофлорою; технологія продуктів мікробного синтезу повинна бути економічно доцільною.

Надсинтез, тобто здатність мікроорганізмів синтезувати певний продукт у кількостях, що перевищують фізіологічні потреби, досить часто зустрічається в природі. Часто той або інший продукт обміну речовин (органічні кислоти, спирти, антибактеріальні речовини), що виділяється мікроорганізмами у навколишнє середовище, є токсичним для інших видів і забезпечує успіх у конкурентній боротьбі за джерела живлення. Саме мікроорганізми з такими властивостями були першими використані у господарській діяльності людини тисячоліття тому, тоді ж було здійснено стихійний відбір найпродуктивніших форм.

Природні штами мікроорганізмів використовують для виробництва мікробної біомаси (мікробного білка), бактеріальних азотних добрив, біопестицидів, у виробництві харчових продуктів та інших галузях. Проте більшість промислових мікроорганізмів представлено штучно селекціонованими штамами. Удосконалені продуценти можуть бути:

1) змінені в результаті індукованих мутацій. Мутації є основою селекції мікроорганізмів з корисними властивостями, штамів-продуцентів антибіотиків, амінокислот або вітамінів. Збільшення мутантів в популяції мікроорганізмів досягається за допомогою індукованих мутацій, що досягається обробкою клітин спеціальними хімічними, фізичними або біологічними агентами.

2)одержані методами генної або клітинної інженерії. Даний підхід отримав назву сайт-спрямованого мутагенезу.

У сучасних умовах промислові масштаби виробництва потребують використання нових високоактивних мутантних і рекомбінантних штамів.

71

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

Також використовують штами із колекцій наукових установ.

Робота № 15. Виділення мікроорганізмів-продуцентів біологічно-активних речовин з ґрунту

З усіх субстратів довкілля найбільш густо заселений мікроорганізмами грунт, в якому вони знаходять всі необхідні умови для своєї життєдіяльності: поживні речовини, вологу, оптимальні значення pH та Eh, співвідношення газів, захист від дії сонячних променів. Найбільшу кількість мікроорганізмів, які в подальшому використовуються в промисловій біотехнології як продуценти промислово важливих речовин виділяють з грунту.

Матеріали та обладнання. Сухі поживні середовища, рідкі (МПБ, пептонна вода), щільні (МПА), напів-рідкі середовища, спеціальні (середовище Чапека для грибів), елективні, диференційно-діагностичні, чисті культури бактерій, вирощені на рідких, напіврідких і щільних поживних середовищах, бактеріологічні петлі; спиртівка; термостат з температурою 37°С; мікроскоп; столик для фарбування препаратів; промивалка з водою; фільтрувальний папір; карболовий фуксин Циля; дистильована вода; імерсійне масло для мікроскопії.

Хід роботи:

1.Відбирання проби грунту для аналізу. Грунт і мікрофлора грунту дуже гетерогенні, тому необхідно відібрати по можливості більш однорідну пробу.

Проби відбирають з верхніх шарів стерильними ковпачками або ножами, з глибини - спеціальними бурами.

Зразки відбирають за принципом "конверта" - в 4-х різних кутах і по діагоналі.

З поверхні дослідної ділянки зсувають рослинні рештки і 0,5-1 см верхнього грунту. В кожній точці відбирають по 100-200г грунту в стерильні мішечки або в стерильні банки із притертими корками. Загальна маса проби повинна бути не менше 1 кг. Грунт пересівають через сито з діаметром отворів 2мм, потім поміщають у стерильні скляні банки з притертими корками або в пластмасові мішки і зберігають при помірній температурі.

2.Виготовлення грунтової суспензії для посіву. Перед аналізом з грунту вибирають дрібні корінці, різні сторонні рештки. Зважують 10 г грунту і висипають у колбу з 100 мл стерильної води. Закриту ватним тампоном колбу струшують на качалці протягом 15 хв. (руками 5 хв.), чекають 30 сек, щоб осіли грубі часточки грунту і роблять наступні розведення. Розведення необхідні для одержання ізольованих клітин

72

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

мікроорганізмів. Коли в колбу до 100 мл води додали 10 г грунту, то одержали розведення 1:10, або перше розведення. Новою стерильною піпеткою набирають 10 мл з першої колби і переносять у другу з 100 мл стерильної води (рис.25).

Рис. 25. Схема приготування і розсіву суспензії мікроорганізмів

Одержують розведення 1:100 (або друге), можна готувати і третє, і четверте розведення.

Одночасно визначають вологість грунту. Для цього в чисті алюмінієві бюкси, попередньо висушені при 105ºС протягом 24 годин до постійної маси і зважені, поміщають 10 г грунту і зважують. Висушують бюкси в сушильній шафі при 105°С протягом 24 год. і знову зважують.

Вологість грунту розраховують за формулою :

( P1 – P2) х 100

W =

P2 - P

де W - вологість,%; P - маса бюкса, г; Р1 - маса грунту разом з бюксом до висушування; Р2 - маса грунту разом з бюксом після висушування.

Поправку на вологість розраховують за формулою:

100+ W

к =

100

де к - поправка на вологість.

3.Посів в чашки Петрі з поживним середовищем. Залежно від насичення грунту мікроорганізмами, вибір кількості розведень може змінюватись, але повинно бути не менше двох. Чим родючіший грунт, тим більше необхідно зробити розведень (4-5). Висівати суспензію можна поверхневим або глибинним способами (повторність досліду 2-4).

73

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

П о в е р х н е в и й п о с і в . Агаризовне середовище розігрівають на водяній бані. Розливають по 20 мл у стерильні чашки Петрі, дотримуючись правил стерильності, і чекають поки воно застигне. На поверхню стерильного агару біля запаленої спиртівки наносять 0,1 мл суспензії стерильною піпеткою і рівномірно розподіляють її по всій поверхні агару за допомогою стерильного скляного шпателю.

Засіяні чашки поміщають у термостат кришками донизу. На чашках пишуть прізвище студента, групу, факультет і номер розведення.

4.Підрахунок колоній у чашці Петрі і розрахунок кількості мікроорганізмів у 1 г грунту. На поживному середовищі в чашці Петрі виростають колонії грунтових мікроорганізмів. Колонія - це видиме неозброєним оком скупчення мікробних клітин.

Колонії бактерій підраховують через 3-5, грибів - через 2-7, актиноміцетів - через 7-15 днів інкубації в термостаті. Колонії рахують, не відкриваючи чашки Петрі. Підрахунок ведуть у тих чашках, де при посіві виросло від 50 до 150 колоній бактерій і актиноміцетів, 30-50 колоній грибів. Якщо колонії менше 10, то такі чашки не враховують. Якщо колоній багато, то чашку Петрі ділять на чотири сектори восковим олівцем і підраховують кількість колоній в секторі, потім результат сумують. Підрахувавши кількість колоній на всіх паралельних чашках, знаходять середнє значення для однієї чашки і за формулою вираховують кількість мікроорганізмів у 1 г сухого грунту.

х = a х b х k,

де x - кількість мікроорганізмів у 1 г сухого грунту, колоній/г; a - середня кількість колоній у чашці Петрі; b - розведення, з якого зроблено посів (з протилежним знаком х10); k - поправка на вологість. Наприклад, середня кількість колоній 60, розведення 10000, вологість 20%.

100100

x = 60 х10000 х10 х 1,2 = 7200000 колоній/г=7,2х106 колоній/г

Найбільш типові колонії відсівають у пробірки зі скошеним агаром

для одержання чистої культури мікроорганізмів і зберігають для подальшого вивчення.

Контрольні питання:

1.Назвіть методи вивчення кількості мікроорганізмів у грунті. З'ясуйте переваги і недоліки методів.

74

РОЗДІЛ 5. ПРИНЦИПИ ТА МЕТОДИ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВИХ ШТАМІВ ПРОДУЦЕНТІВ

2.Через який час підраховують кількість виросших колоній мікроорганізмів?

3.Чи є залежність між родючістю грунту і чисельністю мікроорганізмів певних еколого-трофічних груп ?

5.Охарактеризуйте методику визначення кількості мікроорганізмів різних фізіологічних груп (азотфіксаторів, амоніфікаторів, нітрифікаторів і т.д.).

6.Охарактеризуйте методику визначення мікробів-антагоністів і встановлення їх активності.

Робота №16. Дослідження морфологічних особливостей промислово важливих штамів мікроорганізмів

Характеристика культуральних і фізіолого-біохімічних особливостей мікроорганізмів включає опис їх здатності рости на різноманітних живильних середовищах і викликати певні перетворення речовин, що входять до складу цих середовищ.

1.Ріст на щільних живильних середовищах.

На поверхні щільних живильних середовищ в залежності від посіву

мікроорганізми можуть рости у вигляді колонії, штриха або суцільного газону. Колонією називають ізольоване скупчення клітин одного виду, що виросли в більшості випадків з однієї клітини. При їх описі враховуються наступні ознаки:

–Форму колонії - округла, амебовидних, неправильна, ризоїдна і т. д.;

–Розмір (діаметр) колонії, вимірюють в міліметрах; якщо розміри колонії не перевищують 1 мм, то їх називають точковими;

–Поверхня колонії - гладка, шорстка, бороздчата, складчаста; зморшкувата, з концентричними колами або радіально складчаста;

–Профіль колонії - плоский, опуклий, кратероподібний, конусоподібний;

–Блиск і прозорість - колонія блискуча, матова, тьмяна, мучниста, прозора;

–Колір колонії - безбарвна (темно-білі колонії відносять до безбарвних) або пігментована - біла, жовта, золотава, помаранчева, бузкова, червона, чорна. Особливо відзначають виділення пігменту в субстрат.

2.Ріст в рідких живильних середовищах.

Характеризуючи ріст мікроорганізмів в рідкому середовищі, відзначають ступінь мутності - слабка, помірна або сильна, особливості плівки – тонка, щільна або пухка, гладенька або складчаста, а при утворенні осаду вказують на його кількість (невелика чи велика), щільний, пухкий, слизистий або пластівчастий. Нерідко ріст мікроорганізмів

75