Материал: Melnuchuk_Promuslova biotexnologij

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

Біореактор, що працює в хемостатному режимі культивування, називається хемостат. Він включає: 1) пристрій для подачі живильного середовища; 2) пристосування для відтоку культуральної рідини з клітинами; 3) систему контролю швидкості протоки.

Один з найпростіших варіантів хемостату містить насос, постійно що постійно нагнітає живильне середовище в біореактор, і випускну трубу, по якій рідину з біореактора відбирають, якщо її рівень піднімається вище горловини. Альтернативний варіант - випускна труба входить в порожнину біореактора зверху і нижній обріз її горловини відповідає рівню, вище якого рідина не повинна підніматися. Якщо цей рівень перевищений, надлишок культурального середовища з клітинами відбирається насосом, приєднаним до випускної труби.

Турбідостатний режим культивування заснований на прямому контролі концентрації біомаси. Найбільш поширене вимірювання світлорозсіювання вмісту біореактора з допомогою фотоелементу. Сигнал від фотоелементу управляє швидкістю протоку рідини, що у свою чергу визначає швидкість росту культури. Підвищення концентрації клітин і відповідно світлорозсіювання автоматично призводять до прискорення протоку рідини, що розбавляє культуру, і, навпаки, спад біомаси компенсується уповільненням протоку.

Концентрація клітин може оцінюватися також за непрямими критеріями (по вимірюванню рН, убутку субстрату або накопичення продуктів життєдіяльності). Безперервне культивування, здійснене в одному біореакторі, позначається як одностадійне. Багатостадійне культивування з послідовним або каскадним розташуванням реакторів дозволяє впровадити принцип диференційованих режимів у безперервні біотехнологічні процеси. Ці диференційовані режими не змінюють один одного в часі, а одночасно здійснюються в послідовно розташованих апаратах. Наприклад, у першому з біореакторів створюють оптимальні умови для росту культури, а в другому - для біосинтезу цільового продукту.

Мета: дати уявлення про методи, інструментальне оформлення та можливості методу проточних культур.

Матеріали та обладнання:

1.Лабораторний ферментаційний комплекс «Bio-Flo»;

2.Стерильні розчини для приготування живильного середовища;

3.Інокулят (посівна культура);

4.ФЕК;

5.Скляний посуд, колби, мірні склянки, піпетки, бюкси.

Хід роботи:

1. У мікробіологічному боксі (або боксі-ламінарі) з маточних стерильних розчинів приготувати 1 л живильного середовища;

66

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

2.У оброблену УФ-опромінювачами кімнату внести необхідне обладнання (середовище, інокулят);

3.Посуд з середовищем з'єднати з насосом-дозатором, підключеним до ферментеру;

4.У ферментер влити інокулят (1 л);

5.Включити аеропомпу;

6.Включити систему перемішування і термостабілізації;

7.Виміряти вихідну оптичну щільність (ОЩ) інокуляту;

8.Фіксувати в робочому журналі температуру культури;

9.При досягненні температури 30ºС почнеться ріст культури;

10.Періодично (через 30 хв.) відбирати проби для визначення оптичної щільності культури. При оптичній щільності культури 0,1 (без

розведення) включити насос-дозатор на мінімальну швидкість протоку (0,1 год-1);

11.Щогодини визначати ОЩ культури;

12.При збільшенні ОЩ поступово збільшувати швидкість протоку середовища до стану steady-state (величина Х, г/л - постійна);

13.Обчислити значення питомої швидкості росту культури, визначити час досягнення стану steady-state, отримати культуру (зберігати

вхолодильнику) для наступних занять.

Контрольні питання :

1.У чому принципова відмінність проточної культури від періодичної?

2.Які основні вимоги до організації проточної ферментації?

3.Які переваги проточної культури?

Робота № 14. Проведення процесу ферментації з лімітуванням субстрату

Процеси мікробного синтезу діляться на два типи: 1) процеси, пов’язані з ростом біомаси, що відбуваються паралельно зі швидкістю розмноження клітин, і 2) процеси, що відбуваються або прискорюються при уповільненні швидкості росту клітин.

Оптимізація обох типів процесів здійснюється різними шляхами в залежності від того, наскільки співпадають (або не співпадають) оптимізація швидкості росту зі швидкістю синтезу макромолекул тієї чи іншої природи.

Процес росту – це процес синтезу первинних метаболітів (амінокислот, органічних кислот, вітамінів, нуклеотидів, проміжних продуктів катаболізму) і їх збирання в основні клітинні макромолекули (білки, нуклеїнові кислоти, полімери, що утворюють клітинну стінку). Ріст і синтез цих продуктів максимальний, коли клітина максимально забезпечена субстратом. У періодичній культурі це має місце в

67

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

експоненціальній фазі росту. Таким чином, оптимізація процесу накопичення максимальної біомаси клітин у культурі та синтезу первинних продуктів обміну зводиться до оптимізації умов живлення і створенню умов збалансованого росту для культури. Накопичення продуктів обміну, що відбуваються в другій фазі розвитку культури (кінець лінійної – стаціонарна фаза) - запасних сполук (поліфосфатів, поліцукрів, ліпідів) або вторинних продуктів обміну (антибіотиків, терпенів, стероїдів), має для промислової біотехнології велике значення. Накопичення запасних сполук у клітинах має місце при незбалансованому рості внаслідок вичерпання із середовища певних елементів живлення і лімітування процесу синтезу основних макромолекул. Синтез вторинних продуктів обміну (ідіолітів) має місце у випадку уповільнення і зупинки росту клітин в кінці розвитку популяції (кінець стаціонарної фази - фаза відмирання), коли відбувається дерепресія ферментів, які каталізують реакції утворення даних сполук і репресованих на стадії збалансованого росту. Оптимізація процесу синтезу запасних сполук і вторинних метаболітів більш складна, оскільки вимагає спеціальних знань про закономірності утворення тих чи інших макромолекул і специфічних підходів у кожному конкретному випадку.

При лімітування росту мікроорганізмів окремими елементами мінерального живлення відбувається уповільнення швидкості росту клітин, що супроводжується значними змінами хімічного складу, головним чином, співвідношення основних і запасних макромолекул. Виявлення принципіальних закономірностей цих змін відкриває широкі можливості для спрямованої зміни складу мікробної біомаси та цільового отримання конкретних продуктів мікробіологічного синтезу. Більше того, крім зміни спрямованості біохімічної програми синтезу основних і запасних сполук лімітування росту клітин тим чи іншим мінеральним елементом дозволяє додатково регулювати хімічну структуру окремих сполук, що входять до складу клітин.

Відправним моментом є зміна співвідношення C/N в живильному середовищі. Клітини, лімітовані по азоту і не здатні синтезувати основні сполуки (білки і нуклеїнові кислоти), споживаючи вуглець, направляють його на утворення різних безазотистих сполук вуглецевої і ліпідної природи. Якісний склад запасних сполук, синтезованих при лімітуванні росту мікроорганізмів по азоту на фоні збільшення вмісту вуглецю (збільшення відношення C/N), визначається специфікою фізіологобіохімічних властивостей конкретних мікробних видів, а також штамів.

Мета: освоєння техніки ведення процесу вирощування мікроорганізмів з лімітуванням субстрату для знаходження умов росту, що впливають на біохімічну програму синтезу макромолекул.

Матеріали та обладнання:

1. Музейна культура штаму R. eutrophus B-5786;

68

РОЗДІЛ 4. ТИПИ ФЕРМЕНЦІЙНИХ ПРОЦЕСІВ

7.Провести посів культури в ферментер для періодичного вирощування бактерій, відбір проб і визначення в них інтенсивності світіння і оптичної щільності.

8.Провести відбір проб з ферментера, визначення світіння і оптичної щільності. Провести злив ферментера, підготовку до стерилізації та стерилізацію ферментера. Розрахунок умов безперервного культивування клітин.

9.Посіяти культури в ферментер для безперервного культивування бактерій, відібрати проби для визначення оптичної

щільності і світіння. Перевести культури на безперервний процес вирощування, зробити відбір проб, проведення аналізів, побудову графіків кривої росту культури.

10. Провести злив ферментера, розбирання та миття, відділення біомаси, руйнування на пресі або ультразвуком, визначення ферментативної активності і кількості АТФ.

Контрольні питання:

1.У чому специфіка метаболізму воденьокиснюючих хемоавтотрофних мікроорганізмів?

2.У чому основні труднощі культивування газовикористовуючих мікроорганізмів?

3.Що дозволяє фіксувати в ході культивування водневих бактерій метод Шлегеля?

70