Материал: Bilet_1
Вышеприведённые схемы реакций соответствуют идеальному случаю. Однако в реальных условиях в молекулах белков не по одному карбоксилу. Поэтому: биоспецифическая модификация, блокировка, а иногда и варьирование условий с целью повысить избирательность конъюгации.
Кроме карбодиимидов к первому классу конъюгирующих агентов относятся реагент Вудворда (результат – амидная связь), карбонилдиимидазол (амидная или карбаматная, если гидроксил вместо карбоксила). Реакции с данными молекулами проходят по схожим с карбодиимидной механизмам, но использование связано с бóльшими затруднениями, поэтому применяются такие методы редко.
Конденсация карбонильной группировки с аминогруппой идёт в необычайно мягких условиях (комнатная температура, нейтральный рН), поэтому эту реакцию часто используют для кросссшивания молекул. Этот метод можно отнести к конъюгации с нулевой длиной, однако никаких специфических реагентов для проведения реакции не требуется. Таким способом обычно конъюгируют гликопротеины: остатки сахаров можно обработать периодатом натрия -> расщепление скелета углевода с образованием альдегидных групп. Такое модифицированное соединение легко реагирует с молекулами, содержащими аминогруппы. Продуктом реакции является неустойчивое шиффово основание. Для придания надежности связи между молекулами шиффово основание восстанавливают (с помощью боргидрида натрия, например) до вторичного амина.
Гомобифункциональные кросслинкеры – соединения, содержащие две одинаковых группировки на концах «мостика», непосредственно входящего в состав продукта реакции. Конъюгация с такими реагентами применяется для создания шарнирных участков между молекулами, что может многократно повысить активность компонентов конъюгата. Наиболее популярными агентами этого класса являются диальдегиды, например глутаровый альдегид: в результате реакции со сшиваемыми молекулами образуется соединение с двумя шиффовыми связями, разделенными углеводородным мостиком. Однако, это всё так старомодно, что уже не употребляется (на самом деле, глутаральдегид может быть употреблен лишь для сшивания карбоксильных групп, что сильно ограничивает область его применения). Высокомерный Миша!
Для конъюгации молекул, содержащих аминную группировку, применяются сукцинимидные эфиры (DSP), имидоэфиры (DMA, DTBP), производные дифторобензола (DFDNB, DFDNPS) и фенилазиды. Агенты, содержащие фенилазидные группировки, являются фотоактивируемыми кросссшивающими реагентами (наряду с DFDNPS).
Также существуют реактивы, применяемые при конъюгации по сульфгидрильным группировкам. Таковыми являются малеимиды, бис-алкилгалиды и производные пиридина (DPDPB).
Гомобифункциональные кросслинкеры могут образовывать димеры вследствие гомологичности реакционных групп субстрата. Такое затруднение минует гетеробифункциональные кросслинкеры – соединения, несущие две различные группировки. Наиболее популярным агентом такого класса является имидоэфир фенилазида, сочетающий в себе свойства имидоэфиров, вступающих в реакцию присоединения с аминогруппами, и фотоактивируемого фенилазида.
Трифункциональные кросслинкеры используются для специфичной конъюгации трёх молекул. Такие соединения несут три различные группировки, например азидную, биотиновую и нитрофенильную (4-азидо-2-нитрофенилбиоцитин-4-нитрофениловый эфир, SBED, наиболее часто используемый трифункциональный кросслинкер). Довольно интересное применение нашли трифункцинальные кросслинкеры в исследовании белок-белковых взаимодействий: с помощью кросслинкеров можно «запечатлеть» момент реагирования:
Некоторые сшивающие реагенты предоставляют очень полезную возможность разрывания связи в месте конъюгации – так называемые расщепляемые кросслинкеры. Такое свойство обусловлено строением мостика (spacer), включающего один из следующих компонентов:
1.дисульфидную связь, легко расщепляемую дитиотреитолом или меркаптоэтанолом;
2.диоловую связь (распадается под действием периодата);
3.сульфоновую связь, разрываемую действием гидроксиламина.
Билет 4
1. Пептидные антибиотики и пептиды-иммунорегуляторы
Итак, благо у пептидов и белков есть много разных функций, есть у них и функции, имеющие отношение к иммунитету и вообще защите организма от всякого. В Овчинникове есть много разных антибиотиков, и пептидных, и не очень, но что-то мне подсказывает, что лекционных достаточно.
Т.о., есть в природе куча пептидов-антибиотиков: амебопоры, цекропины, протегрины, магейнины, грамицидины, дефенсины и прочая, прочая…
Есть всякие иммуноактивные пептиды, как то:
1) тафцин (тетрапептид Thr—Lys—Pro—Arg, являющийся фрагментом СН2-домена IgG,
противоопухолевый и антибактериальный, выделяется в селезенке, стимулирует фагоциты, повышает цитотоксическую и цитостатическую активность против чужеродных клеток);
2)хемотактический (продуцируется E.coli, привлекает макрофагов);
3)пептиды тимуса: тимулин, тимопоэтин, тимозины, тимоген, тимопентин, сывороточный фактор тимуса. Последний – вообще со всех сторон молодец: индуцирует Т-клеточные маркеры на Т-клеточных предшественниках, стимулирует Т-клеточный иммунитет (появление цитотоксичных Т- клеток, отторжение MSV-саркомы), стимулирует Т-хелперов, усиливает Т-супрессию (снижая продукцию антител против тимус-независимых антигенов, снижение чувствительности к динитрофторбензолу, депрессия реакции отторжения аллотрансплантанта).
Очень важны гликопептиды клеточных стенок бактерий – они распознаются, тем самым стимулируя иммунную систему (антигенные детерминанты).
Один из основных представителей группы пептидных регуляторов иммунитета — антибиотик циклоспорин А, продуцируемый микроорганизмом Trichoderma polysporum,— обладает выраженными иммунодепрессивными свойствами. В конформационном отношении этот циклоундекапептид аналогичен грамицидину S. Циклоспорин А ингибирует отторжение пересаженных органов и тканей и для этих целей широко применяется в клинике. Мишенью его действия является Т-хелперная популяция лимфоцитов. Увы, отрицательное действие на органы (нарушает обмен жиров и микроэлементов, функцию почек, вызывает артериальную гипертензию, тремор, спазмы и многое другое)
2.Химические методы расщепления полипептидной цепи белка по остаткам W, Y
Большое число методов предложено для расщепления белка по карбонильной группе остатка триптофана. Одним из используемых для этой цели реагентов является N-бромсукцинимид:
Под влиянием электрофильного агента карбонильная группа остатка триптофана способна вступать в 1,5-взаимодействие с двойной связью индольного кольца, при этом происходит окисление индола до гидроксииндолина, сопровождающееся разрывом пептидной цепи. Реакция проводится при 2 — 3-кратном избытке реагента (рН 4,0; 20С; 2 ч). Расщепление триптофансодержащих пептидов N-бромсукцинимидом происходит с выходом 50 — 90%, а белков — лишь 10—60%. N- Бромсукцинимид способен расщеплять также связи, образованные карбонильными группами
остатков тирозина и гистидина, однако в более жестких условиях (увеличение избытка реагента, повышение температуры и понижение рН).
Более селективным реагентом является 2-(2-нитрофенилсульфенил)-3-метил-3-броминдол (BNPS-скатол), получаемый обработкой 2-(2-нитрофенил) сульфенилскатола N-бромсукцинимидом
(А. Фонтана, 1972)
При действии на белки BNPS-скатола происходит специфичное расщепление пептидной цепи только по остаткам триптофана. Остатки метионина при этом окисляются до метионинсульфона. Оптимальные условия проведения реакции: 50%-ная уксусная кислота, 37 °С, 24 ч, 10-кратный избыток BNPS-скатола, выход составляет 30 — 70%. Реакция протекает по механизму, аналогичному механизму расщепления N-бромсукцинимидом. В 1979 г. М. Хермодсон предложил новый метод расщепления пептидных связей, образованных остатками триптофана, с помощью о- иодозобензойной кислоты. Реагент селективно разрывает связи Тгр — X, не модифицируя остатки тирозина и гистидина; метионин может окисляться до сульфоксида. Остатки цистеина и цистина необходимо предварительно защищать путем S-алкилирования. Реакция проводится в 80%-ной уксусной кислоте в присутствии 2-кратного избытка о-иодозобензойной кислоты в течение 24 ч при 20 °С, выход достигает 70 — 100%.
Расщепление цепи по тирозину можно проводить дальнейшим окислением после такого:
3.Фотоактивируемые кросс-сшивающие реагенты
Бифункциональные агенты, содержащие фенилазидные группировки, являются фотоактивируемыми кросс-сшивающими реагентами (еще DFDNPS). Еще соли диазония, которые реагируют с боковыми цепями остатков лизина, цистеина, тироксина и гистидина, а также фотоактивируемые реагенты, например NAP-таурин.
В табл. 1 перечислен также ряд неполярных фотоактивируемых реагентов, которые используются для избирательной модификации аминокислотных остатков белка, контактирующих с гидрофобной областью бислоя. Эти реагенты обычно добавляют к мембранному препарату, дают им возможность накопиться в бислое и затем подвергают их фотоактивации. Преимущество образующихся при этом нитренов и карбенов состоит в том, что их реакции намного менее специфичны по сравнению с реакциями других активных частиц, так что ковалентная модификация не ограничивается боковыми цепями каких-либо определенных аминокислот. Правда, нитрены проявляют избирательность по отношению к нуклеофилам. Использование карбенов предпочтительнее, поскольку они вступают в реакцию с более высоким выходом. Для получения информации о вторичной структуре трансмембранных участков полипептидной цепи путем определения тех остатков, которые контактируют с липидами, использовали реагент ТИД. Например, спираль С бактериородопсина включает метку лишь с одной стороны; это согласуется с
представлением о том, что данная спираль является трансмембранной, причем ее неполярная область обращена в липидную фазу.
А это мы слышали от Гринкевича.
Билет 5 1. Типы взаимодействий, определяющих пространственную структуру полипептидов.
Элементы вторичной и третичной структур белка. Конфигурация пептидной связи. Углы φ, ω, ψ. Карты Рамачандрана.
Каждый белок или пептид специфическим образом свернут в пространстве, и эта конформация определяет его физико-химические и биологические свойства. Пространственная структура белка (пептида) в целом кодируется его первичной структурой. Эта взаимосвязь создает предпосылки для теоретических расчетов и предсказаний вторичной структуры белков на основе их аминокислотной последовательности. Пространственная структура достаточно подвижна, т. е. способна изменяться под воздействием внешних условий или различных агентов, и в этом смысле правильнее говорить о предпочтительной конформации белка или пептида, энергетически наиболее выгодной.
Пептидная связь в белках является практически плоской (отклонения до 5 — 10° в обычных условиях); большие деформации возможны в напряженных циклических системах. Пептидная связь примерно на 10% короче обычной, простой С—N и имеет характер «частично двойной» связи — C=N—. Возможно, это все «резонанс» между двумя формами пептидной связи а и б.
В белках и пептидах связь С—N является частично кратной (в) из-за взаимодействия неподеленной пары электронов атома азота с π-электронной системой карбонильной группы.Обычно пептидная связь имеет транс-конфигурацию. В напряженных циклических системах (некоторые циклопептиды, производные пролина и т. п.), а также при большом размере заместителей у атома азота в N-алкилированных производных пептидная связь может существовать в плоской цис-форме. Цис- и транс-пептидные связи можно различить с помощью физических методов (ИК-, ЯМРспектроскопии и др.). В белках пептидная связь практически всегда имеет транс-конфигурацию.
34. Валентные углы и длины связей (нм) в транс- и цис-пептидных связях (а и б).
Взвене пептидной цепи, включающем две плоские пептидные связи с подвижным сочленением
вточке, где находится асимметрический углеродный атом (рис. 34) повороты возможны вокруг двух
простых связей N—Сα и Сα—С, примыкающих к асимметрическому атому. Согласно принятой номенклатуре, такие повороты измеряются двугранными углами φ (N—Сα) и ψ (Сα—С); нередко используются также углы ω (вращение вокруг пептидных связей С—N) и др. (вращение вокруг связей Сα—Сβ, Сβ—Сγ и т. д.). В качестве нулевой точки отсчета принимается конформация (рис. 35),
вкоторой φ = ψ = ω = 0° (заслоненное расположение остатков основной пептидной цепи). Направление отсчета углов — положительных (до + 180°) и отрицательных (до — 180°) — на рисунке 35 показано стрелками.