Материал: Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия

ВВЕДЕНИЕ. Здесь мы рассмотрим следующие антибиотики: гликопептидный антибиотик ванкомицин, который активен против штаммов Staphylococсus aureus, устойчивых к действию метициллина; его аналог авопарцин, применяемый в качестве кормовой добавки; гликозид линкомицин, очень эффективно действующий против грамположительных энтеробактерий; а также монензин, который используют на птицефабриках для профилактики инфекций, вызываемых простейшими. Несмотря на то что нуклеозидные антибиотики – природные соединения, в медицине используются только продукты химического синтеза. В качестве примера нуклеозидного антибиотика здесь рассмотрен ацикловир – аналог гуанозина, применяемый для лечения вирусного менингита.

ВАНКОМИЦИН И АВОПАРЦИН. Ванкомицин, продуцентом которого является Amycolatopsis orientalis, применяется в борьбе с энтерококковыми бактериями, устойчивыми к действию пенициллина, например при септическом эндокардите. Этот антибиотик часто используется для лечения пациентов, страдающих аллергией на β-лактамные антибиотики. Ванкомицин оказывает негативное действие на почки, поэтому при лечении этим антибиотиком необходимо следить за функцией почек. Как и в случае β-ла- ктамных антибиотиков, действие ванкомицина на микроорганизмы заключается в ингибировании образования клеточной стенки бактерий в результате связывания антибиотика с UDP-мурамилпентапептидом. В штаммах, устойчивых к действию ванкомицина, реализуется путь синтеза клеточной стенки с другими промежуточными продуктами, не вступающими в реакцию с этим антибиотиком. Устойчивость к антибиотику, возможно, возникает в результате горизонтального переноса генетической информации посредством транспозонов между людьми, а также домашними животными. Авопарцин – продукт жизнедеятельности Streptomyces candidus, по структуре очень близкий к ванкомицину – в странах ЕС применяется в качестве кормовой добавки. Эксперименты на изолированных транспозонах, обеспечивающих устойчивость к ванкомицину и авопарцину, показали, что, возможно, в организме человека штаммы энтеробактерий, устойчивые к действию этих антибиотиков, возникают по такому же механизму передачи генетической информации. По этой причине в некоторых странах (например, в Дании) авопарцин был запрещен; согласно клиническим наблюдениям, случаи резистентности к ванкомицину стали реже.

ЛИНКОМИЦИН – антибиотик, образующийся в Streptomyces lincolnensis и действующий против грамположительных бактерий. Основное применение линкомицина связано с ветеринарией. Механизм действия

этого антибиотика сходен с действием хлорамфеникола: линкомицин связывается с 50S-субъединицей прокариотической рибосомы и препятствует дальнейшему росту пептидной цепи. К настоящему времени зарегистрировано множество штаммов, обладающих устойчивостью к линкомицину. В таких клетках линкомицин либо подвергается ферментативному разрушению, либо в результате метилирования происходят такие изменения рРНК, что линкомицин не взаимодействует с 50S-субъединицей прокариотической рибосомы.

МОНЕНЗИН – полиэфирный антибиотик, который получают в процессе ферментации, осуществляемой

Streptomyces cinnamonensis. Путь биосинтеза монензина аналогичен синтезу поликетидных антибиотиков из ацетата, пропионата и бутирата. Молекулы монензина встраиваются в мембрану и функционируют как ионофоры: они обеспечивают поступление ионов Na+

вклетку и таким образом вызывают осмотический лизис клетки. Такой механизм объясняет чрезвычайно широкий круг организмов, для которых действие монензина является токсичным: к ним относятся не только бактерии и грибы, но и простейшие, например

Eimeria sp. и Toxoplasma sp., вызывающие заболевания на птицефермах. Из-за высокой токсичности монензин не используется в медицине, однако находит широкое применение в качестве кормовой добавки при разведении кур и крупного рогатого скота. На долю монензина и его структурного аналога салиномицина приходится до 80% объема мирового рынка антибиотиков. Производство монензина превышает 3000 т/год, а рыночный оборот составляет 200 млн долл. США.

НУКЛЕОЗИДНЫЕ АНТИБИОТИКИ. Нуклеозидные антибиотики пока находят лишь ограниченное применение. Аналог цитозина, бластицидин S, образующийся

вStreptomyces griseochromogenes, используют при выращивании риса в качестве фунгицида, препятствующего возникновению мучнистой росы. Действие бластицидина S основано на ингибировании связывания аминоацил-тРНК с рибосомой. В лечении заболеваний, вызванных вирусами герпеса, таких как энцефалит, важная роль принадлежит ацикловиру – синтетическому аналогу гуанозина.

ВВЕДЕНИЕ. Открытие стрептомицина, сделанное Зельманом Ваксманом в 1943 г., явилось важной вехой в изучении антибиотиков. Этот препарат был впервые успешно применен для лечения туберкулеза, вызываемого Mycobacterium tuberculosum, – одного из широко распространенных и наиболее опасных заболеваний человека. Стрептомицин, как и большинство аминогликозидных антибиотиков, оказывает различные побочные эффекты, связанные с нарушениями слуха и работы почек, поэтому в настоящее время для лечения туберкулеза используют другие антибиотики (гидразид изоникотиновой кислоты, рифампицин, а ранее часто применяли циклосерин). Молекулы аминогликозидных антибиотиков состоят из кольца аминоциклитола (например, 2-дезоксистрептамин), которое связано с другими остатками аминосахаров гликозидными связями. Аминогликозидные антибиотики, как правило, имеют широкий спектр действия, в том числе они эффективны против грамотрицательных бактерий, поэтому несмотря на относительно высокую токсичность их широко используют в медицине, например при тяжелых инфекциях. Другой областью применения аминогликозидных антибиотиков является сельское хозяйство, где они служат для защиты растений. Объем рынка аминогликозидных антибиотиков достигает 800 млн долл. США в год. В медицинских целях наиболее важное значение имеют следующие антибиотики группы аминогликозидов: гентамицин, неомицин, тобрамицин, позднее гентамицин, канамицин, полусинтетические продукты сизомицин и амикацин, а в специальных случаях – стрептомицин. Спектиномицин используют при лечении заболеваний, вызванных штаммами Neisseria gonorrhoeае, устойчивыми к пенициллину. Касугамицин применяют при выращивании риса для профилактики мучнистой росы, а гидромицин используют в ветеринарии.

БИОСИНТЕЗ. Большинство аминогликозидных антибиотиков образуются в прокариотических организмах – представителях Streptomyces и Micromonospora. Биосинтез аминогликозидных антибиотиков включает множество стадий (например, в случае стрептомицина их насчитывается 24), при этом D-глюкоза связывается с нуклеозидом, затем образуется аминоциклитольное кольцо, к которому через гликозидные связи присоединяются специфические сахара (С-разветвленные сахара, аминосахара). В синтезе стрептомицина принимают участие 33 белка, гены которых образуют крупный генный кластер размером 30–40 т.п.н. на хромосоме S. griseus. Многие из этих генов клонированы.

ПОЛУЧЕНИЕ. Для получения более высоких выходов аминогликозидных антибиотиков постоянно ведется работа по созданию новых штаммов. Так, в результа-

те многократного повторения раундов мутагенеза с последующим отбором мутантов удается повысить выход продукта, например стрептомицина: в диком штамме синтезируется нескольких миллиграммов на литр, а в штаммах-суперпродуцентах выход антибиотика превышает 10 г/л после 120 ч роста. В промышленности для выращивания культуры используют биореакторы с большим рабочим объемом. В качестве источника углерода служат глюкоза, крахмал или декстрин, а источником азота – соевая мука. Аминогликозидные антибиотики, в частности гентамицин, выделяются в среду роста, после того как рН среды доводен до 2,0. После отделения клеточной массы следует концентрирование культуральной жидкости, из которой в дальнейшем методом ионообменной хроматографии получают очищенный антибиотик.

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ. Антимикробный эффект аминогликозидных антибиотиков объясняется тем, что их молекулы связываются с 30S-субъединицей прокариотической рибосомы и вызывают ошибки трансляции, приводящие к остановке синтеза полипептидных цепей. Некоторые антибиотики группы аминогликозидов специфически взаимодействуют с РНК интронов I группы. Недостаток аминогликозидных антибиотиков заключается в том, что микроорганизмы достаточно быстро вырабатывают механизм устойчивости к их действию. В результате ферментативного ацетилирования, фосфорилирования или аденилирования гидроксильных групп в структуре рибосомы, ее связывание с молекулами антибиотика нарушается. Ферменты, осуществляющие такие специфические модификации, закодированы в плазмиде или хромосоме микроорганизма.

ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИЕ АМИНОГЛИКОЗИДНЫЕ АНТИБИОТИКИ. Путем химических превращений аминокислот получают, как правило, полусинтетические аминогликозидные антибиотики (сизомицин, амикацин, тобрамицин). Несмотря на то что многие гены ферментов, участвующих в биосинтезе аминогликозидных антибиотиков, клонированы, в настоящее время синтез с использованием этих ферментов в промышленных масштабах экономически невыгоден. Это объясняется прежде всего чрезвычайно сложными механизмами регуляции активности ферментов биосинтеза.

ВВЕДЕНИЕ. Благодаря широкому спектру действия антибиотики группы тетрациклинов находят широкое применение как в медицине, так и в ветеринарии (2004 г.: 880 млн долл.). Производные налидиксовой кислоты (антибиотики ряда хинолонов) также обладают широким антимикробным спектром действия и после лактамных антибиотиков являются наиболее часто используемыми в современной медицине. Объем рынка хинолонов в 2004 г. превысил 5,8 млрд долл. США.

Тетрациклины. С тех пор как в 1945 г. впервые был описан хлортетрациклин, продукт жизнедеятельности

Streptomyces aureofaciens, появилось множество производных тетрациклина. Для человека эти вещества слаботоксичны, но эффективно действуют против грамотрицательных и грамположительных бактерий, риккетсий, микоплазм, лептоспир, спирохет и некоторых крупных вирусов. Антимикробное действие антибиотиков тетрациклинового ряда основано на том, что они связываются с 70S-субъединицей прокариотической рибосомы и тем самым препятствуют синтезу белка. К сожалению, в некоторых странах неумеренное добавление этих антибиотиков в корма в птицеводстве и свиноводстве привело к появлению резистентных штаммов, число которых неуклонно растет. Наиболее часто механизм устойчивости к действию антибиотика заключается в изменении свойств внешней клеточной оболочки, в результате чего антибиотик не проникает внутрь клетки. Кроме того, в клетке могут синтезироваться так называемые тет-белки, которые осуществляют активный транспорт молекул антибиотика из клетки. Гены таких белков находятся в плазмидах. Тетрациклины образуются в процессе жизнедеятельности стрептомицетов. Биосинтез включает более 70 реакций, в результате которых из глюкозы образуются поликетидные производные, в том числе окситетрациклин. В промышленности для получения тетрациклиновых антибиотиков клетки штаммов-суперпродуцентов культивируют в биореакторах с большим рабочим объемом. Для получения высоких выходов продукта (до 25 г/л) необходимо, чтобы в среде поддерживался высокий уровень кислорода, а концентрация фосфатов не превышала оптимального значения. После проведения ферментации клетки удаляют из культуральной жидкости, методом многоступенчатой экстракции н-бутилацетатом выделяют антибиотик, а затем очищают его посредством ионообменной хроматографии.

Антрациклины. Действие антрациклиновых гликозидов, например доксорубицина (адриамицина), заключается в ингибировании ферментов-топоизомераз путем интеркаляции, что приводит к прекращению репликации ДНК. В клинической медицине эти препараты используют при лечении злокачественных опухолей. Промышленное получение антрациклиновых антибиотиков основано на ферментации.

Хинолоны. Бактерицидный эффект налидиксовой кислоты – промежуточного продукта химического синтеза антималярийного препарата хлороквина – был открыт еще в 1962 г., однако лишь в 1977 г. удалось показать, что механизм действия этого антибиотика заключается в ингибировании бактериальной топоизомеразы (гиразы А). Структуры прокариотической и эукариотической топоизомераз значительно отличаются, поэтому антибиотики ряда хинолонов не взаимодействует с эукариотическим ферментом, а значит обладают низкой токсичностью для человека. Для хинолоновых антибиотиков характерен широкий спектр антимикробного действия: грамположительные и грамотрицательные бактерии, микобактерии, хламидии, анаэробные бактерии и др. Развитие резистентности у микроорганизмов может быть результатом модификаций гиразы или пониженной проницаемости клеточной мембраны для молекул антибиотика. Поскольку гены, ответственные за возникновение такой резистентности, находятся в хромосоме, а не в плазмиде, образование новых устойчивых штаммов протекает чрезвычайно медленно. Из более чем 5000 производных хинолона, получаемых исключительно методом химического синтеза, многие находят широкое применение в медицине, например ципрофлоксацин (Ciprobay®), действующий против Bacillus anthracis.

Хлорамфеникол был выделен из Streptomyces venezuelae еще в 1950 г., однако в современном производстве этот антибиотик получают исключительно методом химического синтеза. Предшественник хлорамфеникола хоризмовая кислота образуется как промежуточный продукт при биосинтезе ароматических аминокислот. Хлорамфеникол был первым антибиотиком с широким спектром антимикробного действия; он активен против многих грамотрицательных и грамположительных бактерий, актиномицетов, риккетсий и крупных вирусов. Однако из-за нежелательных побочных эффектов, в том числе затрагивающих костный мозг, в современной медицине хлорамфеникол используется только в качестве резервного препарата при лечении тифа и инфекционных заболеваний, вызванных шигеллами и риккетсиями. Механизм действия заключается в связывании молекул антибиотика с 50S-субъединицей 70S-рибосом, что приводит к ингибированию активности пептидилтрансферазы.

Гризеофульвин – производное бензофурана, применяется в качестве фунгицида. Действие гризеофульвина заключается в том, что он препятствует митозу в клетках грибов, в результате чего образуются морфологически измененные и функционально неполноценные гифы. Этот антибиотик получают путем ферментации и используют для лечения грибковых заболеваний кожи человека, а также для защиты растений от различных заболеваний типа мучнистой росы.